孫國祥 饒志 魏玉輝

蘭州大學第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

他克莫司（Tacrolimus，F(xiàn)K506）是一種從霉菌養(yǎng)物中分離的新型免疫抑制劑，其免疫抑制活性為環(huán)孢素A 的50～100 倍，目前已在肝臟、腎臟、心臟、胰腺等器官移植中得以廣泛應用［1］。雖然他克莫司已成為器官移植術后及自身免疫系統(tǒng)相關疾病治療的一線用藥，但由于在其應用中存在治療窗窄，患者個體差異較大，且不良反應（如腎毒性、神經(jīng)毒性、糖耐量下降、肝功能異常、高血壓等）發(fā)生率較高等問題，在臨床患者應用其治療時需進行血藥濃度監(jiān)測。此外，在他克莫司的諸多不良反應中，腎毒性對患者機體的損害尤為突出，因此在他克莫司的臨床應用過程中，還須監(jiān)測血肌酐濃度，以對患者腎功能做出評估。目前關于LC-MS/MS 法應用于他克莫司全血濃度的測定方法已有大量研究［2-4］，但應用LC-MS/MS 同時進行人血中他克莫司及肌酐的定量測定方法尚未見報道，因此本實驗擬建立一種快速、靈敏、專屬性強的LC-MS/MS 同時測定人全血中他克莫司及肌酐濃度的方法，并將其應用于臨床血藥濃度測定中。

1 材料

1.1 儀器 安捷倫1260 型高效液相色譜儀，安捷倫6460 型串聯(lián)質(zhì)譜質(zhì)譜儀；高速離心機（深圳國華儀器廠）；SHZ-Ⅲ型循環(huán)真空水泵（上海亞榮生化儀器廠），LT-224S 電子天平（北京賽多利斯）；XW-80A 漩渦混合器（上海醫(yī)科大學儀器廠）。

1.2 試劑 他克莫司標準品（浙江省食品藥品檢驗所，純度：97.7%，批號：20120314）；子囊霉素對照品（湖北威德利化學科技有限公司，純度97.5%，批號：100101）；肌酐對照品（合肥博美生物科技有限責任公司，純度99.0%，批號：17110323）；乙腈為色譜純，購自山東禹王實業(yè)公司禹城化工廠；甲醇為色譜純，購自德國默克公司；去離子水為蘭州大學第一醫(yī)院藥劑科自制。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱選用安捷倫Zorbax Eclipse Plus C18 柱（4.6mm×100mm，3.5μm）；流動相為甲醇-水溶液等度洗脫，洗脫比例為85 ∶15；流速為1mL/min，應用三通進行柱后分流（分流比1 ∶4，v/v）；柱溫為50℃；進樣量為20μL。

2.2 質(zhì)譜條件 離子源選用電噴霧離子源（ESI）；毛細管電壓為5000V；干燥氣溫度為350℃；干燥氣流速為11L/min；霧化氣壓力40psi；應用多反應監(jiān)測模式（MRM）進行正離子掃描，EMV 設定為200V。MRM 監(jiān)測離子對：他克莫司m/z 826.2 →616.1，碰撞能36V，碎裂電壓200V；肌酐m/z 114.3 →44.0，撞能量16 V，碎裂電壓60V；子囊霉素（內(nèi)標）m/z 814.1 →604.0，碰撞能量36V，碎裂電壓200V。該質(zhì)譜條件下他克莫司、肌酐及子囊霉素的子離子掃描質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 他克莫司（A）、肌酐（B）及子囊霉素（C）的子離子掃描質(zhì)譜

2.3 標準品及內(nèi)標儲備液配制 取他克莫司對照品適量，約相當于他克莫司2.0mg，精密稱定。置于5mL容量瓶中，用乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度約為390.8μg/mL 的他克莫司儲備液；稱取肌酐標準品適量，約相當于肌酐1.5mg，精密稱定，置于10mL容量瓶中，用乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，配置成質(zhì)量濃度約為150.0μg/mL 的肌酐儲備液；取子囊霉素對照品適量，約相當于子囊霉素2.1mg，置于5mL 容量瓶中，用乙腈稀釋后配成420.0μg/mL 的子囊霉素儲備液。將上述試劑置于4℃冰箱中儲存。

2.4 樣品處理 離心管中加入全血樣品200μL，然后依次加入10μL 濃度約為420ng/mL 的內(nèi)標工作液及20μL 飽和硫酸鋅溶液，渦旋混勻，加入1mL 甲基叔丁基醚，渦旋1min，14000r/min 離心8min，取上層有機相800μL 于另一離心管中，室溫下氮氣吹干，加入100μL流動相復溶，渦旋混勻，14000r/min 離心5min，取上清液進樣20μL。

2.5 標準曲線制備 將他克莫司儲備液及肌酐儲備液用乙腈稀釋成系列混合標準溶液，其中含他克莫司質(zhì)量濃度約為390.8、195.4、97.7、48.85、24.43、12.21、6.11ng/mL，含肌酐質(zhì)量濃度約640、320、160、80、40、20、10μg/mL。精確吸取上述系列混合標準溶液各50μL，分別加入空白全血450μL，配置成含他克莫司質(zhì)量濃度約為39.08、19.54、9.77、4.89、2.44、1.22、0.61ng/mL 的標準全血樣品，其中含肌酐質(zhì)量濃度約64、32、16、8、4、2、1μg/mL。按“2.4”項下方法操作，進樣分析。他克莫司以濃度為橫坐標，待測物與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標進行為回歸分析后求得回歸方程；肌酐也以其質(zhì)量濃度為橫坐標，其扣除本底后的峰面積與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標，進行回歸分析后求得回歸方程。

2.6 方法學確證

2.6.1 專屬性。本研究色譜質(zhì)譜條件下他克莫司、肌酐以及內(nèi)標的峰形良好，保留時間分別在1.2min，2.9min及2.8min，全血中其他內(nèi)源性物質(zhì)不干擾分析物測定，其色譜圖見圖2。

圖2 他克莫司及肌酐的人全血LC-MS/MS 色譜圖

2.6.2 標準曲線及定量范圍。本方法中，他克莫司測定的回歸方程為Y=0.926099X+0.033751，R2=0.9991，線性范圍為0.61～39.08ng/mL，最低定量限為0.15ng/mL（S/N＞10）；肌酐測定的回歸方程為Y=56.761118X+294.809368，R2=0.9998，線性范圍為1～64μg/mL，最低定量限為0.5μg/mL（S/N＞10）。本研究中他克莫司及肌酐在全血中的定量范圍內(nèi)線性關系良好，符合測定要求。

2.6.3 精密度。按“2.5”項下方法配制高、中、低3 個濃度樣品，每個濃度分別測定，1 天內(nèi)測定5 次，此為日內(nèi)精密度；連續(xù)配制3 天，每天分別測定，此為日間精密度，其檢測結果如表1 所示。

表1 他克莫司及肌酐在人全血中的精密度（n=6，±s）

表1 他克莫司及肌酐在人全血中的精密度（n=6，±s）

檢測物 添加濃度 日內(nèi)精密度 日間精密度測定濃度 RSD（%） 測定濃度 RSD（%）1.21 1.08±0.13 12.04 1.11±0.15 13.32 4.89 4.81±0.31 6.44 5.36±0.48 8.94 19.54 19.03±1.07 5.62 18.75±1.32 6.98肌酐（μg/mL）他克莫司（ng/mL）2 1.98±0.16 8.24 1.73±0.14 7.93 8 9.83±0.37 3.76 9.92±0.52 5.25 32 30.56±1.01 3.31 31.2±1.24 3.98

2.6.4 基質(zhì)效應及提取回收率。取空白全血18 份，除以相同體積乙腈替代標準溶液、內(nèi)標溶液外，其余按“2.5”項下操作，在氮氣吹干后加入含低、中、高濃度混合標準溶液及內(nèi)標的流動相溶液各6 份，進樣記錄所得他克莫司及肌酐濃度數(shù)據(jù)為SET1；配制低、中、高濃度乙腈溶液的質(zhì)控樣品各6 份，進樣記錄所得數(shù)據(jù)為SET2；配制低、中、高濃度乙腈溶液質(zhì)控樣品各6 份，依照“2.5”項操作，所得結果記為SET3，以SET1：SET2計算基質(zhì)效應，SET3：SET1 計算提取回收率，所得RSD值小于13.8%，質(zhì)控結果符合樣品測定要求。

2.6.5 穩(wěn)定性。本研究中血樣經(jīng)凍融3 次、室溫條件靜置8h 及-80℃冰箱凍存21 天后測定，其RSD 值均小于10.7%，表明待測物在該條件下穩(wěn)定，符合測定要求。

2.7 方法學應用 本研究共選取12 例患者，應用他克莫司治療，均為口服給藥，給藥間隔12h，抽取其達藥物穩(wěn)態(tài)谷濃度后的靜脈血進行測定，其臨床資料及測定結果見表2。

表2 12 例患者的臨床資料、他克莫司及肌酐在血中的濃度

3 討論

目前應用于他克莫司血藥濃度監(jiān)測的方法有微粒酶免疫分析法（MEIA 法）［5］、酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）［6］及液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS/MS）等。ELISA 法和MEIA 法測定時，體內(nèi)代謝物可能與原藥產(chǎn)生交叉反應，其測定結果較LC-MS/MS 將明顯偏高［7-8］，而LC-MS/MS 由于具有專屬性強，靈敏度及準確度高的特點，從而能更準確反映他克莫司原型藥物的體內(nèi)血藥濃度特征，因此適用于他克莫司治療藥物監(jiān)測及藥代動力學研究，并被用來作為該藥物測定方法的參考金標準［9］。他克莫司的LC-MS/MS 法測定前處理方法有沉淀蛋白法、液液萃取法及固相萃取法等，本研究在方法建立時需綜合考慮各種前處理方法對人血液中他克莫司及肌酐測定的影響，經(jīng)實驗比較發(fā)現(xiàn)沉淀蛋白及液液萃取兩種方法較固相萃取法簡單、省時，適合應用于治療藥物監(jiān)測中，而沉淀蛋白法內(nèi)源性物質(zhì)去除能力不如液液萃取法，在對他克莫司及肌酐進行同時測定時會影響樣品測定的穩(wěn)定性及靈敏度，因此本研究確定選用液液萃取法做樣品前處理。在對二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚、甲基叔丁基醚等不同種類的萃取試劑及這些試劑不同比例的相互配比進行反復實驗后發(fā)現(xiàn)，單用甲基叔丁基醚對待測物及內(nèi)標的萃取效果最為穩(wěn)定，因此本研究選用甲基叔丁基醚作為萃取試劑。在色譜條件的優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)，柱溫對他克莫司及內(nèi)標峰形的影響至關重要，柱溫越高其峰形及響應越好，但過高的柱溫勢必對色譜柱造成較大損傷，因此本研究在嘗試不同柱溫后，最終確定檢測柱溫為50℃，待測物及內(nèi)標的峰形均較為理想。

腎毒性是他克莫司治療過程中主要的不良反應之一，患者在服用此藥物后可造成經(jīng)常性腎功能異常以及偶發(fā)性或特異性腎組織受損、透析依賴性腎功能衰竭、蛋白尿、血尿、腎水腫等，還可導致溶血性尿毒癥及腎小球病的發(fā)生，因此在他克莫司的治療過程中必須密切關注腎功能的變化。肌酐是人體內(nèi)的小分子內(nèi)源性物質(zhì)，可通過腎小球濾過，且在腎小管內(nèi)很少被重吸收，因此血肌酐是評價腎功能的重要指標之一。肌酐的正常值參考范圍為4.98～12.21μg/mL，在本研究選取的12 例檢測樣本中有5 例肌酐值明顯高于正常范圍，檢測結果提示此5 例患者可能發(fā)生了不同程度的腎損傷，在后期的用藥及治療中應密切監(jiān)測血藥濃度及腎功能變化情況，防止嚴重腎毒性的發(fā)生。

綜上所述，本實驗建立的應用LC-MS/MS 同時測定血中他克莫司及肌酐的方法，操作簡單、快速且精密、準確，可應用于他克莫司的治療藥物監(jiān)測中。