范芳芳，鄒 力，魏寧果，安 瑜

陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西西安 710048

0 引言

維生素A（Vitamin A，VA）和E（Vitamin E，VE）是人和動(dòng)物維持正常的生理功能而必需的微量有機(jī)物質(zhì)，具有促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)、維持視力發(fā)育、促代謝以及抗衰老的重要作用[1]。維生素A的活性形式包括視黃醇、視黃醛和視黃酸3 種衍生物，其中視黃醇是VA主要的天然存在形式，主要存在于動(dòng)物體內(nèi)[2]。VE又稱生育酚，目前發(fā)現(xiàn)的主要包括α-T，β-T，γ-T，δ-T 4 種生育酚和α-TT，β-TT，γ-TT，δ-TT 4種生育三烯酚[3]。由于VA和VE結(jié)構(gòu)復(fù)雜，異構(gòu)體較多，準(zhǔn)確測(cè)量比較困難。國(guó)內(nèi)外學(xué)者致力于VA和VE的檢測(cè)研究較多，目前主要有微生物法法、光譜分析法、色譜質(zhì)譜分析法、加壓毛細(xì)管電色譜法、電化學(xué)分析法等[4]。本文主要綜述了電化學(xué)分析法、分光光度法、液相色譜（串聯(lián)質(zhì)譜）法以及氣相色譜（串聯(lián)質(zhì)譜）等檢測(cè)方法的操作過程以及結(jié)果研究，對(duì)比分析了各種方法優(yōu)缺點(diǎn)，為提升VA和VE的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 電化學(xué)法

電化學(xué)法是利用待測(cè)物質(zhì)在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)而引起的電位變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物質(zhì)的定性或定量檢測(cè)[5]。有研究以甲苯和乙醇的混合溶液為提取溶劑，采用計(jì)時(shí)電位滴定法，測(cè)定了4 種植物油中的VE，該法最低檢出限為15 mg/dm3[6]。尹淑濤等[7]采用恒電位聚合的方法，快速檢測(cè)植物油中的VE，該法相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9963，最低檢出限為2×10-6mol/L（S/N＝3）。電化學(xué)方法具有靈敏度高、設(shè)備成本低、操作簡(jiǎn)單、易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，適用于食品快檢。開發(fā)新的電極材料，同時(shí)實(shí)現(xiàn)VA和VE在乳制品等食品中的快速檢測(cè)是今后的發(fā)展趨勢(shì)。

2 分光光度法

分光光度法是通過測(cè)定目標(biāo)物質(zhì)在特定波長(zhǎng)處或一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光度，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性定量的分析方法，在食品檢測(cè)領(lǐng)域有著非常重要的應(yīng)用[8]。李湘玲等[9]采用分光光度法測(cè)定維生素E丸中的VE含量，該法測(cè)得回收率為99.71%~100.21之間，變異系數(shù)為0.24%（n＝5）。劉樹恒[10]在表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨的存在下利用VE將Fe3＋還原為Fe2＋，以5-硝基-1，10-菲咯啉為顯色劑采用分光光度法間接測(cè)定VE，該法相關(guān)系數(shù)0.9993，VE的含量在0.3~2.0 mg/L范圍內(nèi)，符合比耳定律，該法檢測(cè)結(jié)果與《中國(guó)藥典》中VE的檢測(cè)方法所得結(jié)果一致。分光光度法與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法（正交法、最小二乘法等）聯(lián)用，以及分光光度計(jì)與其他檢測(cè)儀器聯(lián)用，都可以使其應(yīng)用范圍進(jìn)一步擴(kuò)大。

3 氣相色譜（串聯(lián)質(zhì)譜）法

在液相色譜技術(shù)發(fā)展起來以前，脂溶性維生素多采用氣相色譜（串聯(lián)質(zhì)譜）法進(jìn)行分析檢測(cè)。氣相色譜（串聯(lián)質(zhì)譜）法是以氣體為流動(dòng)相的色層分離分析方法，該法在乳制品等食品中VA和VE的檢測(cè)應(yīng)用如表1。

表1 氣相色譜（串聯(lián)質(zhì)譜）法在食品中VA和VE的檢測(cè)應(yīng)用

氣相色譜法測(cè)定VE所用色譜柱從填充柱到毛細(xì)管柱再到表面修飾或者化學(xué)改性的色譜柱[15]，具有靈敏度高，干擾小、分離度高、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)。由于氣相色譜法流動(dòng)相為氣體，升溫溫度過高，對(duì)熱不穩(wěn)定性VA檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，雖說氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法能夠解決這一問題，但是儀器設(shè)備昂貴，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)不便于普遍推廣。

4 液相色譜法

液相色譜法是以液體為流動(dòng)相的色譜分析方法，基本原理是基于固定相對(duì)目標(biāo)物和雜質(zhì)的吸附能力不同而分離，并定量檢測(cè)。我國(guó)的國(guó)標(biāo)方法和國(guó)際歐盟的方法均采用液相色譜法，因此該法是乳制品等食品中VA和VE檢測(cè)的主流方法，也是被各位學(xué)者研究最多的方法之一。液相色譜法又分為反相液相色譜和正向液相色譜。

4.1 反向液相色譜

反向液相色譜在乳制品中VA和VE的檢測(cè)應(yīng)用主要是以GB5009.82—2016[16]第一法為代表，包括皂化、液液提取、洗滌、濃縮等步驟。該法操作步驟繁瑣、使用有機(jī)試劑較多、重現(xiàn)性較差，我國(guó)學(xué)者在此基礎(chǔ)上，對(duì)各個(gè)步驟的條件優(yōu)化研究較多。鄒力等[17]優(yōu)化了國(guó)標(biāo)方法，提出實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)，該法VA和VE的回收率分別為92.95%和90.66%，相對(duì)偏差分別為1.98%和1.48%，且重現(xiàn)性較好。本文從是否皂化、提取方式、提取溶劑以及應(yīng)用范圍等方面對(duì)我國(guó)近年來反向液相色譜在乳制品等食品中VA和VE的檢測(cè)應(yīng)用進(jìn)行研究（表2）。由上表可知：

（1）乳制品等食品中VA和VE的提取溶劑有石油醚、乙醚、正己烷、甲醇、乙醇等有機(jī)試劑，這些溶劑的提取效果基本都能滿足要求。

（2）乳制品等食品中脂溶性維生素會(huì)被蛋白質(zhì)、脂肪等有機(jī)大分子會(huì)以各種形式包裹在食品顆粒中，需要水解皂化，釋放出來，但保健食品基質(zhì)簡(jiǎn)單，組分單一，無需皂化，直接提取，即可得到較好的分離效果。Turner等[32]等研究用酶解樣品的形式代替皂化過程，使維生素和脂肪達(dá)到分離的目的。

（3）液液提取容易產(chǎn)生乳化，這是實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差的主要影響因素之一。在線固相萃取技術(shù)克服了這一問題，又減少了人工操作，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。

（4）高效液相雙波長(zhǎng)檢測(cè)以及多波長(zhǎng)熒光檢測(cè)器的聯(lián)用為同時(shí)測(cè)定VA和VE提供了設(shè)備保障，減少了分析時(shí)間。

（5）在線二維色譜（正向色譜和反相色譜聯(lián)用）技術(shù)為同時(shí)測(cè)定VA、VE和VD的含量提供了新思路，縮短了分析時(shí)間，適用于批量化處理，但是表2涉及文獻(xiàn)的VA和VE測(cè)定均為二維色譜中的反向色譜。

表2 反向液相色譜在乳制品等食品中VA和VE的檢測(cè)應(yīng)用

（6）反向色譜技術(shù)具有平衡時(shí)間短、使用有機(jī)試劑種類少等優(yōu)點(diǎn)，但是無法實(shí)現(xiàn)VA和VE的8 種異構(gòu)體完全分離的目的。

4.2 正向液相色譜

正向液相色譜在乳制品等食品中脂溶性維生素的檢測(cè)應(yīng)用主要是以GB5009.82—2016[16]第二法為代表的VE檢測(cè)方法，該法不經(jīng)過皂化，液液提取后濃縮進(jìn)樣。相對(duì)于反向高效液相色譜來講，具有操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、能夠分離VE的8 種異構(gòu)體的優(yōu)點(diǎn)，該法的研究進(jìn)展如表3。由上表可以看出：

表3 正向液相色譜在乳制品等食品中VA和VE的檢測(cè)應(yīng)用

（1）該法的提取溶劑主要為己烷、醚類等極性有機(jī)溶劑。

（2）樣品非經(jīng)皂化，液液萃取法直接提取即可分離出目標(biāo)物。

（3）正向高效液相色譜法在乳制品等食品中VE的分析檢測(cè)中優(yōu)勢(shì)較為明顯。但由于正向高效液相色譜存在平衡時(shí)間長(zhǎng)，有機(jī)溶劑使用種類多量大等缺點(diǎn)[36]，在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用并不普及。

5 高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是一種集高效分離、多組分定性、定量于一體的分析方法，尤其對(duì)熱不穩(wěn)定性化合物的分離和鑒定具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法在乳制品等食品中VA和VE的檢測(cè)應(yīng)用如表4。

由表4可以看出，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)樣品前處理中提取溶劑、提取方式以及是否皂化等因素并無特殊要求，樣品前處理凈化方式除了液液提取，固相萃取外，也可使用凝膠色譜法。該法基質(zhì)干擾小、并且能夠同時(shí)檢測(cè)大部分的VA和VE異構(gòu)體，但是儀器設(shè)備貴，需要加內(nèi)標(biāo)，成本較高，食品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室很難達(dá)到全面普及。

表4 高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法在乳制品等食品中VA和VE的檢測(cè)應(yīng)用

6 超高效合相色譜法

超高效合相色譜法（Ultra PerformanceConvergence Chromatography，UPC2） 是近年來結(jié)合了液相色譜和氣相色譜技術(shù)而發(fā)展起來的一種分析方法。以超臨界流體CO2為流動(dòng)相主體，將氣相色譜和液相色譜優(yōu)勢(shì)完美結(jié)合，為結(jié)構(gòu)極其相似的手性化合物的拆分提供可能。周圍等[42]采用異丙醇-正己烷（1:1，V/V）溶液提取復(fù)合維生素片中11 種脂溶性維生素（VA、VE、VD、VK）及其衍生物，并與超高效合相色譜（UPC2）技術(shù)聯(lián)用，達(dá)到了很好的分離效果，該法加標(biāo)回收率范圍為97.31% ~98.76%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.41%~0.96%，為多種脂溶性維生素在食品中同時(shí)檢測(cè)提供了技術(shù)支持。

UPC2法具有環(huán)境污染小、靈敏度高、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高以及運(yùn)行成本低等優(yōu)點(diǎn)，并為同時(shí)檢測(cè)乳制品等食品中VA和VE所有異構(gòu)體提供了新的研究方法。

7 結(jié)論

實(shí)現(xiàn)前處理的自動(dòng)化以及多種同分異構(gòu)體同時(shí)檢測(cè)是乳制品等食品中VA和VE檢測(cè)的研究趨勢(shì)和發(fā)展方向，但是開發(fā)一種重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高并且我國(guó)大部分食品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室都能普及的檢測(cè)方法更具有實(shí)際意義，即該檢測(cè)方法既要做到技術(shù)上可行，也要做到經(jīng)濟(jì)上合理。本文從前處理是否需要造化、提取方式、提取溶劑、檢測(cè)儀器、方法適用范圍以及檢測(cè)效果等方面綜述了電化學(xué)法、分光光度法、氣相色譜（串聯(lián)質(zhì)譜法）、液相色譜法、液相質(zhì)譜法、高效液相合相色譜法的研究進(jìn)展。這為乳制品等食品中VA和VE的前處理和上機(jī)分析的進(jìn)一步條件優(yōu)化提供參考，為我國(guó)食品監(jiān)管部門實(shí)現(xiàn)多方位多層級(jí)監(jiān)管提供技術(shù)支撐。