張 偉，朱壯彥，張海燕，韓麗炘，張建業(yè)，周雯敏，閆燕艷,*

（1.大同市第二人民醫(yī)院（腫瘤醫(yī)院），山西大同 037005；2.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西大同 037009；3.廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東省分子靶標(biāo)與臨床藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 511436）

結(jié)腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，好發(fā)于直腸與乙狀結(jié)腸交界處。由于結(jié)腸癌的侵襲性高、預(yù)后差和缺乏靶向治療，其發(fā)病率在全球中排名第三[1]。由于結(jié)腸癌患者的早期癥狀不明顯，只有40%左右的患者能在疾病的早期診斷出來。手術(shù)切除仍是II～I(xiàn)II期結(jié)腸癌患者的最佳治療選擇，也是局部結(jié)腸癌患者和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者的治療選擇，但30%～50%的患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)，且發(fā)現(xiàn)與癌癥相關(guān)死亡風(fēng)險(xiǎn)較高?；熓峭砥诮Y(jié)腸癌患者最重要的治療方法之一，其中以5-Fu 為基礎(chǔ)的輔助化療及姑息化療應(yīng)用最為廣泛，5-Fu 可通過干擾腫瘤細(xì)胞的核酸代謝進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。盡管全身性的藥物治療取得了一定的進(jìn)展，長期給藥5-Fu 引起結(jié)腸癌細(xì)胞的原發(fā)或繼發(fā)性耐藥仍然是化療成功的主要障礙[2]。目前5-Fu耐藥的分子機(jī)制尚不明確，因此構(gòu)建5-Fu耐藥體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯ι钊胙芯磕[瘤耐藥機(jī)制具有重要的意義。本研究采用藥物逐步遞增法誘導(dǎo)穩(wěn)定的SW620/Fu 和LoVo/Fu 耐藥細(xì)胞株，對親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞進(jìn)行比較，初步探討其生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620 和LoVo 購自ATCC公司。

1.1.2 主要試劑

5-Fu 購自Sigma 公司，0.25%胰蛋白酶購自Gibco 公司，F(xiàn)12K 培養(yǎng)基、L15 培養(yǎng)基、PBS 緩沖液、胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液及Formazan 溶液購自iCell公司，MTT購自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620 和LoVo 分別在含10%胎牛血清的L15 培養(yǎng)基和F12K 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)和密度更換培養(yǎng)液或傳代。SW620 細(xì)胞培養(yǎng)使用密封培養(yǎng)瓶，LoVo 細(xì)胞培養(yǎng)使用透氣培養(yǎng)瓶。待細(xì)胞匯合度達(dá)到85%以上時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 MTT法檢測親本細(xì)胞的IC50值

取對數(shù)期生長的人結(jié)腸癌細(xì)胞消化處理后，按1×104/孔將細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基更換為含不同濃度5-Fu 的完全培養(yǎng)基：6.25，12.5，25，50，100，200，400，800，1 600 μmol/L。每孔200 μL，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后，取出96 孔板，使用排槍將提前配置好的20 μL MTT（5 mg/mL）溶液加入到每個(gè)培養(yǎng)孔中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后，取出96孔板，吸除培養(yǎng)基，排槍每孔加入150 μL Formazan溶液，置搖床上低速振蕩10～30 min，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀在570 nm處測量各孔的吸光值，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。細(xì)胞抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組平均吸光值/對照組平均吸光值）× 100。

1.2.3 人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株的建立和鑒定

應(yīng)用濃度遞增法誘導(dǎo)得到耐藥細(xì)胞株。取對數(shù)生長期的SW620和LoVo細(xì)胞以10×105/孔接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長穩(wěn)定，匯合度約80%時(shí)，將培養(yǎng)基更換為相應(yīng)含藥完全培養(yǎng)基，SW620 為55 μmol/L，LoVo 為151 μmol/L。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，更換為不含藥物的完全培養(yǎng)基，視細(xì)胞死亡速度調(diào)整換液頻率。細(xì)胞生長匯合度達(dá)到80%左右，按1∶2的比例傳代。待細(xì)胞貼壁后，再加入2 倍濃度的5-Fu 的完全培養(yǎng)基刺激細(xì)胞24 h，更換為不含藥物的完全培養(yǎng)基并換液。藥物遞增濃度如下：①SW620 細(xì)胞為55，110，220，440 μmol/L；②LoVo 細(xì)胞為151，302，604 μmol/L。約170 d時(shí)，細(xì)胞在最大藥物濃度可正常生長，匯合度約80%，視為耐藥株，并分別命名為SW620/Fu，LoVo/Fu。用Axygen 的基因組抽提試劑盒提取DNA，采用21-STR擴(kuò)增方案擴(kuò)增，在ABI 3730XL型遺傳分析儀上對STR位點(diǎn)和性別基因Amelogenin進(jìn)行檢測。

1.2.4 MTT法檢測耐藥細(xì)胞的IC50值

采用MTT 法檢測5-Fu 對耐藥細(xì)胞SW620/Fu 和LoVo/Fu 的IC50值，步驟同1.2.2。細(xì)胞抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組平均吸光值/對照組平均吸光值）× 100。耐藥指數(shù)（resistance index,RI）=耐藥細(xì)胞IC50/親代細(xì)胞IC50。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以上所有試驗(yàn)重復(fù)3次，應(yīng)用Graphpad Prism 7.0軟件作圖，SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P ＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株SW620/Fu 和LoVo/Fu 的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和鑒定

SW620 和LoVo 細(xì)胞經(jīng)過遞增濃度的5-Fu 作用后，歷時(shí)約6 月成功在體外構(gòu)建5-Fu 獲得性耐藥細(xì)胞株SW620/Fu 和LoVo/Fu。倒置顯微鏡下觀察到兩種人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株均貼壁生長，胞質(zhì)見空泡形成、顆粒增多，具有持續(xù)的活性并能穩(wěn)定增殖。此外，人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株SW620/Fu 和LoVo/Fu 與短串重復(fù)序列（short tandem repeat,STR）分析結(jié)果高度匹配。

2.2 5-Fu 對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620 和SW620/Fu、LoVo和LoVo/Fu的生長抑制作用

根據(jù)MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，人結(jié)腸癌兩對細(xì)胞的生存率隨著5-Fu 濃度的增加而降低（圖1）。5-Fu 對SW620和SW620/Fu細(xì)胞的IC50值分別為58.17±3.54和443.71 ± 14.27 μmol/L；對LoVo 和LoVo/Fu 細(xì)胞的IC50值分別為152.53±13.95 和1049.54±70.51 μmol/L(均P＜0.05)。由耐藥指數(shù)（RI）=耐藥細(xì)胞IC50/親代細(xì)胞IC50公式得到SW620/Fu 細(xì)胞的耐藥指數(shù)為7.63，LoVo/Fu細(xì)胞的耐藥指數(shù)為6.88。

圖1 5-Fu對人結(jié)腸癌細(xì)胞的生長抑制作用

3 討論

結(jié)腸癌是一個(gè)嚴(yán)重威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題，其發(fā)病率和死亡率位于癌癥統(tǒng)計(jì)的前列。目前常見的治療包括手術(shù)治療、化療、放療和免疫治療等，然而大多數(shù)結(jié)腸癌患者仍存在化療失敗和腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，可能是由藥物抵抗和多藥耐藥造成的[3]。

5-Fu 是治療結(jié)腸癌的一個(gè)基礎(chǔ)化療藥物，主要通過影響體內(nèi)的代謝藥物，使其插入DNA 或RNA 中造成細(xì)胞損傷，從而達(dá)到抗腫瘤的效果。然而，5-Fu耐藥的產(chǎn)生常常影響大多數(shù)結(jié)腸癌患者的化療效果。在體外和臨床研究中，胸腺嘧啶合成酶（thymine synthase,TS）和二氫嘧啶脫氫酶（dihydropyrimidine dehydrogenase,DPYD）的活性增強(qiáng)是腫瘤細(xì)胞對5-Fu 耐藥的主要機(jī)制[4]。此外，5-Fu 耐藥還跟DNA 損傷修復(fù)異常、細(xì)胞周期改變、凋亡缺陷等情況密切相關(guān)。對5-Fu耐藥相關(guān)機(jī)制的研究有助于開發(fā)新型有效抗癌化療方案，因此構(gòu)建耐藥癌細(xì)胞系、闡明腫瘤耐藥機(jī)制，是改善5-Fu耐藥患者預(yù)后的重要途徑。

目前，國內(nèi)外相繼建立了乳腺癌、食管鱗癌、胰腺癌等的5-Fu 耐藥細(xì)胞株模型。Takahashi 等人通過將三陰性乳腺癌細(xì)胞反復(fù)暴露于逐步增加的5-Fu濃度，建立了5-Fu 耐藥細(xì)胞系MDA-MB-231/5-Fu，其IC50值是親代細(xì)胞MDA-MB-231 的5.5 倍[5]。Zhang等人通過逐步增加5-Fu濃度建立了5-Fu耐藥的食管鱗癌細(xì)胞株Eca-109/5-Fu，結(jié)果表明耐藥相關(guān)蛋白、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白和癌癥干細(xì)胞相關(guān)蛋白在兩種細(xì)胞株之間表現(xiàn)出顯著差異[6]。張厚斌等人采用5-Fu低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量沖擊誘導(dǎo)法建立了獲得性的Patu8988/5-Fu 多藥耐藥細(xì)胞株，耐藥基因MDR1 的表達(dá)上調(diào)和HIF-1α 介導(dǎo)的凋亡耐受可能是Patu8988/5-Fu 獲得性耐藥的相關(guān)機(jī)制[7]。此外，5-Fu 耐藥的結(jié)直腸癌細(xì)胞株亦有報(bào)道，如HT-29/5-Fu[8]、SW480/5-Fu[9]、LS174T/5-Fu[10]等，但以SW620 和LoVo 細(xì)胞建立5-Fu 耐藥細(xì)胞株的研究較少。

本研究采用藥物逐步遞增法誘導(dǎo)方法，歷時(shí)約6 月，成功建立了穩(wěn)定的SW620/Fu 和LoVo/Fu 耐藥細(xì)胞株。耐藥細(xì)胞株的誘導(dǎo)過程實(shí)際上是通過增大藥物濃度將大部分對藥物敏感的細(xì)胞殺死，僅有少數(shù)不敏感的腫瘤細(xì)胞存活并進(jìn)行擴(kuò)增。相對于親代細(xì)胞，顯微鏡下觀察到SW620/Fu 和LoVo/Fu 的形態(tài)有不同程度的差異，胞質(zhì)見空泡形成，顆粒增多。我們證實(shí)了耐藥細(xì)胞和親代細(xì)胞存在某種程度上的差異，但尚未明確在結(jié)腸癌中5-Fu 耐藥的調(diào)控機(jī)制。

綜上所述，我們通過藥物逐步遞增法，成功構(gòu)建了5-Fu 耐藥的人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620/Fu 和LoVo/Fu。建立體外耐藥模型對解釋復(fù)雜的耐藥機(jī)制、篩選耐藥靶標(biāo)和逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥具有十分重要的意義，為今后的臨床耐藥研究提供一定的參考價(jià)值。