汪立平 ，賈 爽，張曉妍，周婉婷，張逸鑫

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，上海 201306;3.上海海洋大學(xué)食品熱加工工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

影響食品質(zhì)量關(guān)鍵因素之一是食品安全。細(xì)菌素是天然食品防腐劑之一，可滿足消費(fèi)者保健需求。乳酸菌可調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、降低膽固醇和血壓、提高人體免疫力和抵抗力[1]，具有一定益生特性。此外，乳酸菌代謝產(chǎn)物如有機(jī)酸、酶、細(xì)菌素、乙醇、丁醇、去多糖和雙乙酰也具有應(yīng)用價(jià)值[2]。其中的細(xì)菌素，一般稱為乳酸菌細(xì)菌素。近年來，學(xué)者研究乳酸菌細(xì)菌素特性[3]，篩選拮抗特定指示菌產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌，純化所產(chǎn)細(xì)菌素，探究細(xì)菌素抑菌機(jī)制，使用基因工程手段分析產(chǎn)細(xì)菌素基因。其中全基因組測序已成為調(diào)查食源性疾病重要工具[4]，部分國家已將全基因組測序納入國家食品控制系統(tǒng)。從基因?qū)用娣治鼍臧踩裕捎行袛嗑昕煞裼糜谑称沸袠I(yè)，保障菌株使用安全性。

盡管許多產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌應(yīng)用潛力優(yōu)秀，但乳酸鏈球菌素（NisaplinTM）仍然是唯一獲得美國食品藥品管理局批準(zhǔn)的市售細(xì)菌素，其純化成本較高，不利于產(chǎn)品擴(kuò)大化生產(chǎn)[5]。有必要進(jìn)一步篩選有應(yīng)用價(jià)值的產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌，擴(kuò)大乳酸菌細(xì)菌素市場多樣性。

在前期研究中，從中國廣西北海地區(qū)農(nóng)家自制泡菜產(chǎn)品中篩選到一株產(chǎn)細(xì)菌素植物乳桿菌HY41，發(fā)現(xiàn)其具有廣譜抑菌特性且在發(fā)酵植物基產(chǎn)品時(shí)具有抑制產(chǎn)品后酸化潛力。本研究進(jìn)一步探究菌株潛在適用性和安全性，對(duì)菌株細(xì)菌素生產(chǎn)曲線、抑菌譜和不同環(huán)境穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估，并分析菌株全基因組數(shù)據(jù)，深入分析細(xì)菌素基因編碼產(chǎn)物。研究旨在為該菌株和菌株所產(chǎn)細(xì)菌素進(jìn)一步在食品工業(yè)或其他行業(yè)上應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 菌種及指示菌來源

植物乳桿菌HY41分離自中國廣西北海地區(qū)農(nóng)家自制泡菜。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC 41002）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenesATCC 19116）、沙門氏菌（SalmonellaATCC 15611）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticusATCC 33847）以及大腸桿菌（Escherichia coli，ATCC 25922）購自美國典型微生物菌種保藏中心（American type culture collection,ATCC）。腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）、變異鏈球菌（Streptococcus mutans）、摩根氏菌（Morganella）、豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）、腐敗希瓦氏菌（Shewanella）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）以及近平滑假絲酵母（Candida albicans）均由上海海洋大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：稱取54 g MRS培養(yǎng)基于1 L蒸餾水中，固體培養(yǎng)基添加18 g·L-1瓊脂，煮沸。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1、酵母粉5 g·L-1、氯化鈉10 g·L-1，固體培養(yǎng)基加入10 g·L-1瓊脂，煮沸。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

YPD 培養(yǎng)基：酵母提取物10 g·L-1、蛋白胨20 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1，固體培養(yǎng)基加入18 g·L-1瓊脂，煮沸。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌HY41生長和儲(chǔ)存條件

植物乳桿菌HY41 在MRS 培養(yǎng)基中37 ℃，150 r·min-1生長24 h，并保存在-20 ℃含有40%（V/V）甘油中，測定前傳代培養(yǎng)2次。

1.3.2 瓊脂擴(kuò)散法測定抑菌圈直徑

以單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenesATCC 19116）為指示菌，將單核細(xì)胞增生李斯特菌接種至LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)12 h后，制備成菌濃度為106CFU·mL-1指示菌懸液。將固體LB 培養(yǎng)基加熱熔化，加入1%（V/V）指示菌懸液，混合均勻傾倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后，使用打孔器打下直徑為6 mm 孔，將50 μL 無細(xì)胞發(fā)酵上清液加入到孔中，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈，并測量抑菌圈直徑（mm），每組試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3.3 植物乳桿菌HY41生長曲線及細(xì)菌素生產(chǎn)曲線

參考Yi等方法略作修改[6]。將菌株接種到MRS培養(yǎng)液中培養(yǎng)，37 ℃孵育36 h，每2 h 檢測一次OD600和pH。同時(shí)，8 000 r·min-1，4 ℃離心15 min，過0.22 μm濾膜，制備無細(xì)胞發(fā)酵上清液，作瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。

1.3.4 植物乳桿菌HY41所產(chǎn)細(xì)菌素穩(wěn)定性

1.3.4.1 溫度穩(wěn)定性

分別取等量無細(xì)胞發(fā)酵上清液于離心管中，置于-20、40、50、60、70、80、90、100 ℃水浴和121 ℃高壓釜中加熱10和30 min，然后立即用冰水浴冷卻至室溫，4 ℃保存細(xì)菌素作為對(duì)照[7]，作瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。

1.3.4.2 酸堿穩(wěn)定性

取等量無細(xì)胞發(fā)酵上清液，用6 mol·L-1NaOH溶液和6 mol·L-1HCl 溶液調(diào)節(jié)無細(xì)胞發(fā)酵上清液pH，使樣品pH 為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 和12，37 ℃水浴4 h 后，將各溶液pH 均調(diào)節(jié)至6[8]，作瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。

1.3.4.3 有機(jī)溶液穩(wěn)定性

取等量無細(xì)胞發(fā)酵上清液于離心管中，分別與等體積丙酮、甲醇、乙醇、乙腈混合，對(duì)照組加入等體積無菌水，室溫下作用4 h，作瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。

1.3.4.4 紫外穩(wěn)定性

將等量無細(xì)胞發(fā)酵上清液，置于離心管中，放于超凈工作臺(tái)內(nèi)，用紫外燈照射10、20、30、40、50、60 min后，以未經(jīng)紫外燈照射無細(xì)胞發(fā)酵上清液為對(duì)照，作瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。

1.3.4.5 酶敏感性試驗(yàn)

將蛋白酶K、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶分別在最適pH條件下配置成4 mg·mL-1酶溶液。將其加入無細(xì)胞發(fā)酵上清液中，使其終濃度為2 mg·mL-1，37 ℃水浴4 h[8]，作瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。

1.3.5 植物乳桿菌HY41所產(chǎn)細(xì)菌素部分純化

采用Westley等溶劑提取方法[9]，將植物乳桿菌HY41 培養(yǎng)24 h，制備無細(xì)胞發(fā)酵上清液用于細(xì)菌素粗提。在分液漏斗中以體積比1∶1 混合無細(xì)胞發(fā)酵上清液和乙酸乙酯。劇烈搖晃10 min，靜置分層。分離含有細(xì)菌素的有機(jī)層。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑。將提取物溶解在0.020 mol·L-1PBS（pH 7.4）中，使之濃縮后體積為初始體積0.1 倍。0.22 μm濾膜過濾，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 植物乳桿菌HY41抑菌譜

將部分純化后細(xì)菌素用于抑菌譜測定。采用瓊脂孔擴(kuò)散法測定部分純化后細(xì)菌素抑菌譜。指示菌株包括革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和酵母菌。細(xì)菌類指示菌在LB 培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h。酵母類指示菌在YPD 培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)16 h。

1.3.7 植物乳桿菌HY41所產(chǎn)細(xì)菌素分子質(zhì)量測定

部分純化后細(xì)菌素分子質(zhì)量根據(jù)Schagger等描述方法進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳[10]。

1.3.8 植物乳桿菌HY41全基因組測序及生物信息學(xué)分析

植物乳桿菌HY41 在MRS 培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)22 h，4 ℃、8 000 r·min-1離心15 min，除去上清液，得到菌體，而后由上海美吉生物進(jìn)行第二代細(xì)菌基因組掃描圖測序。

從Illumina 平臺(tái)生成數(shù)據(jù)用于生物信息學(xué)分析。所有分析均使用上海美吉I-Sanger 云平臺(tái)（www.i-sanger.com）。所得全基因組序列對(duì)比GO、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋，將得到序列比對(duì)VFDB毒力基因數(shù)據(jù)庫和CARD抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫，作毒力基因和抗生素抗性基因預(yù)測，使用Diamond 軟件作比較，設(shè)置水平為E＜10-5，序列一致性和序列覆蓋率＞80%[11]。植物乳桿菌HY41編碼細(xì)菌素序列由BAGEL4（http://bagel4.molgenrug.nl/index.php）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行挖掘。

對(duì)于BAGEL4 比對(duì)細(xì)菌素，由在線軟件Prot-Param（https://web.expasy.org/protparam/）分 析 細(xì) 菌素基因編碼產(chǎn)物理化性質(zhì)，在線軟件Conserved Domain（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/lexington/lexington.cgi）分析其保守結(jié)構(gòu)域，在線軟件TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析跨膜螺旋信號(hào)，在線軟件SOMPA（https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)，在線軟件SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）分析其三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌HY41生長曲線及細(xì)菌素生產(chǎn)曲線

植物乳桿菌HY41 在5 h 進(jìn)入對(duì)數(shù)期，在16~36 h 進(jìn)入穩(wěn)定期（見圖1）。酸為一種初級(jí)代謝產(chǎn)物，隨細(xì)菌總量增加而增加。因此，pH 在對(duì)數(shù)期迅速下降，但pH 3.6 時(shí)并未持續(xù)下降。因穩(wěn)定期細(xì)菌總量未增加，故酸度未降低。生產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌在穩(wěn)定期后發(fā)酵液pH小于4.0較為常見[12]。該菌株抑菌活性在10 h 時(shí)達(dá)到最大值，抑菌直徑達(dá)到21.77 mm。隨培養(yǎng)時(shí)間增加，菌株抑菌活性略下降。

圖1 植物乳桿菌HY41生長曲線、pH變化和抑菌圈直徑Fig.1 Growth curve,pH variation and inhibitory zone diameter of L.plantarum HY41

2.2 植物乳桿菌HY41所產(chǎn)細(xì)菌素穩(wěn)定性

2.2.1 溫度穩(wěn)定性

植物乳桿菌HY41產(chǎn)生細(xì)菌素溫度穩(wěn)定性如圖2A 所示。在60 ℃、10 min 條件下，其活性保持在92.06%。當(dāng)60 ℃作用時(shí)間增加至30 min 時(shí)，活性保持在91.04%。滿足一般巴氏殺菌條件，可用于乳制品消殺。隨溫度升高，抑菌物質(zhì)在100 ℃作用10 min 下仍保持83.17%活性，證明在短時(shí)高溫作用下HY41 所產(chǎn)細(xì)菌素活性并未明顯下降。在121 ℃作用30 min 下，細(xì)菌素活性保持在71.52%，表明其可承受高壓蒸汽滅菌，對(duì)溫度耐受性較強(qiáng)。因此，植物乳桿菌HY41產(chǎn)生細(xì)菌素可能屬于一類耐熱細(xì)菌素，可接受短期高溫處理。這與植物乳桿菌R23[11]和植物乳桿菌PKLP5[13]產(chǎn)生細(xì)菌素特性相似。表明在加工過程中該細(xì)菌素可耐受巴氏殺菌和高壓蒸汽滅菌，對(duì)進(jìn)一步延長食品保質(zhì)期具有重要作用。

2.2.2 酸堿穩(wěn)定性

圖2B 表示pH 對(duì)植物乳桿菌HY41 所產(chǎn)細(xì)菌素穩(wěn)定性影響。以pH為5.0時(shí)所產(chǎn)生抑菌圈大小為對(duì)照。菌株HY41 所產(chǎn)細(xì)菌素對(duì)pH 具有較強(qiáng)耐受性，pH 在2.0~10.0 之內(nèi)抑菌活性仍保持在90%以上，在pH達(dá)到11.0時(shí)，活性為81.62%。在極端酸性（pH 2.0）和極端堿性（pH 10.0）情況下仍保持93.95%和92.01%抑菌活性。說明菌株HY41所產(chǎn)細(xì)菌素酸堿穩(wěn)定性良好，在極端環(huán)境下仍可發(fā)揮明顯抑菌作用，有利于食品工業(yè)應(yīng)用。

2.2.3 有機(jī)溶劑穩(wěn)定性

圖2C 表示有機(jī)溶劑對(duì)植物乳桿菌HY41 所產(chǎn)細(xì)菌素穩(wěn)定性影響。與乙醇混合后，抑菌直徑增加0.4 mm（P＜0.05），其余抑菌直徑無明顯變化（P＞0.05）。說明有機(jī)溶劑未降低植物乳桿菌HY41所產(chǎn)細(xì)菌素活性，可為后續(xù)蛋白質(zhì)分離純化試驗(yàn)提供前提。

2.2.4 紫外穩(wěn)定性

圖2D 表示輻照時(shí)間對(duì)植物乳桿菌HY41 所產(chǎn)細(xì)菌素穩(wěn)定性影響。從圖中可看出，隨輻照時(shí)間增加，抑菌直徑逐漸減小，60 min 時(shí)直徑減小0.83 mm。說明紫外照射對(duì)活性物質(zhì)有影響，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 植物乳桿菌HY41所產(chǎn)細(xì)菌素穩(wěn)定性Fig.2 Stability of the bacteriocin produced by L.plantarum HY41

2.2.5 酶敏感性試驗(yàn)

植物乳桿菌HY41 所產(chǎn)細(xì)菌素在蛋白酶K、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶作用下，不顯示抑菌活性。說明該活性物質(zhì)可被蛋白酶水解，因此推斷屬于蛋白類物質(zhì)。

2.3 植物乳桿菌HY41所產(chǎn)細(xì)菌素抑菌譜

從表1 中可知，植物乳桿菌HY41 所產(chǎn)細(xì)菌素具有廣譜抑菌活性，包括革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和酵母類真菌。植物乳桿菌HY41部分純化細(xì)菌素對(duì)5 株革蘭氏陽性菌中金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）及變異鏈球菌（Streptococcus mutans）抑菌直徑分別達(dá)到27.00±0.20 mm、20.57±0.06 mm、25.00±0.26 mm；對(duì)8 株革蘭氏陰性菌中副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、摩根氏菌（Morganella）和大腸桿菌（Escherichia coli）抑菌直徑達(dá)到（21.03±0.15）mm、（24.40±0.78）mm、（18.93±0.23）mm。植物乳桿菌HY41部分純化細(xì)菌素對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌均有抑制作用，但對(duì)革蘭氏陽性菌抑制作用更強(qiáng)。對(duì)漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）和近平滑假絲酵母（Candida albicans）抑菌直徑達(dá)到（21.47±0.42）mm、（19.97±0.06）mm，對(duì)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）無抑菌活性。綜上可知，植物乳桿菌HY41具有廣譜抑菌活性，對(duì)食品腐敗菌和食源性病原菌有較強(qiáng)抑制作用，在食品生產(chǎn)中應(yīng)用潛力巨大。

表1 植物乳桿菌HY41所產(chǎn)細(xì)菌素抑菌譜Table 1 Antimicrobial spectrum of the bacteriocin produced by L.plantarum HY41

2.4 植物乳桿菌HY41所產(chǎn)細(xì)菌素分子質(zhì)量

通過Tricine-SDS-PAGE 凝膠電泳測定部分純化后細(xì)菌素分子質(zhì)量在3.3~5.8 ku。用考馬斯亮藍(lán)G 250染色時(shí)觀察到一條蛋白質(zhì)條帶，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)條帶被單核細(xì)胞增生李斯特菌覆蓋時(shí)，在蛋白質(zhì)條帶位置出現(xiàn)抑菌現(xiàn)象，與超低分子質(zhì)量Marker中活性細(xì)菌素標(biāo)記位置一致，驗(yàn)證得到條帶為抑菌條帶。

圖3 植物乳桿菌HY41所產(chǎn)生細(xì)菌素Tricine-SDS-PAGE電泳圖Fig.3 Tricine-SDS-PAGE analysis and size determination of the bacteriocin produced by the L.plantarum HY41

2.5 植物乳桿菌HY41全基因組測序結(jié)果

2.5.1 植物乳桿菌HY41基因信息

分析植物乳桿菌HY41 全基因組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，編碼該菌株基因數(shù)量達(dá)到2 778，基因總長度達(dá)到2 473 086 bp，基因組平均GC 含量46.02%，具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

表2 植物乳桿菌HY41全基因組測序結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistical table of whole genome sequencing results of L.plantarum HY41

2.5.2 COG功能注釋

COG 注釋結(jié)果見圖4，共2 356 個(gè)基因獲得COG 基因注釋，占所有基因比例為84.81%，共分為19 個(gè)類型，其中占比較大有：轉(zhuǎn)錄（K: Transcription），218 個(gè)基因，占總比例7.85%；碳水化合物運(yùn)輸和代謝（G: Carbohydrate transport and metabolism），206 個(gè)基因，占總比例7.42%；氨基酸運(yùn)輸和代謝（E: Amino acid transport and metabolism），194個(gè)基因，占總比例6.98%。

圖4 植物乳桿菌HY41 COG功能分類Fig.4 COG functional classification of L.plantarum HY41

2.5.3 GO功能注釋

使用blast2go軟件比對(duì)gene ontology數(shù)據(jù)庫，對(duì)植物乳桿菌HY41基因組進(jìn)行GO功能注釋。由圖5可知，2 186 個(gè)基因進(jìn)行GO 功能注釋，占所有基因78.69%。GO 注釋結(jié)果主要分為3 大亞類，在生物學(xué)過程（Biological process）中基因數(shù)量最多為轉(zhuǎn)錄（translation）；在細(xì)胞組分（Cellular component）中基因數(shù)量最多為膜組成部分（integral component of membrane）；在分子功能（Molecular function）中基因數(shù)量最多為ATP結(jié)合功能（ATP binding）。

圖5 植物乳桿菌HY41 GO功能分類Fig.5 GO functional classification of L.plantarum HY41

2.5.4 KEGG功能注釋

對(duì)菌株HY41 進(jìn)行KEGG 功能注釋，共2 508個(gè)基因獲得KEGG功能注釋，將基因組分為六大代謝途徑，新陳代謝（Metabolism，1 913個(gè)基因）、細(xì)胞過程（Cellular processes，70 個(gè)基因）、遺傳信息處理（Genetic information processing，199 個(gè)基因）、人類疾病（Human diseases，86 個(gè)基因）、環(huán)境信息處理（Environmental information processing，200 個(gè)基因）、有機(jī)系統(tǒng)（Environmental information processing，40個(gè)基因）。

2.5.5 抗生素抗性基因和毒力基因檢測

使用Diamond 軟件將植物乳桿菌HY41 全基因組測序數(shù)據(jù)與抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫（CARD）作比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)抗生素抗性基因。同樣在毒力基因數(shù)據(jù)庫（VFDB）中進(jìn)行比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)毒力基因。Joana Barbosa 從芝麻菜中篩選出植物乳桿菌R23[11]，通過全基因組測序鑒定也不含抗生素抗性基因和毒力基因，可認(rèn)為是食品工業(yè)安全培養(yǎng)物，本試驗(yàn)與其研究結(jié)果一致。

圖6 植物乳桿菌HY41 KEGG功能分類Fig.6 KEGG functional classification of L.plantarum HY41

2.5.6 植物乳桿菌HY41細(xì)菌素基因簇挖掘

將全基因組測序結(jié)果用次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇?cái)?shù)據(jù)庫BAGEL4 進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，植物乳桿菌HY41 基因組中存在2 個(gè)潛在熱點(diǎn)區(qū)域（Areas of Interest，AOI）。在組裝Scaffold 33.21上編碼兩種核心蛋白（見圖7A），均屬于II a 類細(xì)菌素且與Pediocin和Pediocin PA 序列重合度高達(dá)100%。在編碼細(xì)菌素基因上游和下游，有兩個(gè)開放閱讀框（orf00004和orf00018）具有復(fù)制蛋白功能。在編碼細(xì)菌素基因下游，開放閱讀框orf00015 編碼細(xì)菌素Pediocin PA 生物合成蛋白Ped C。lan T基因編碼Pediocin PA的ATP結(jié)合蛋白Ped D。開放閱讀框orf00029 編碼重組酶Yoe C。在組裝Scaffold 4.13上編碼兩種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（見圖7B），含有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通常具有抑菌活性[14]。

圖7 植物乳桿菌HY41菌株細(xì)菌素基因簇圖譜Fig.7 Genetic organization map of bacteriocin gene clusters of the L.plantarum HY41

2.6 植物乳桿菌HY41細(xì)菌素基因編碼產(chǎn)物分析

2.6.1 理化性質(zhì)分析

在線軟件分析結(jié)果顯示，植物乳桿菌HY41基因編碼產(chǎn)物Pediocin PA 氨基酸殘基數(shù)量為62 個(gè)，分子量為6 643.64 ku，理論等電點(diǎn)（PI）為9.02，分子式為C284H452N84O86S7，脂肪系數(shù)為55.16，親水系數(shù)為-0.482，不穩(wěn)定系數(shù)為19.72，說明蛋白質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定。帶負(fù)電氨基酸殘基數(shù)（Asp+Glu）為4 個(gè)，帶正電氨基酸殘基數(shù)（Arg+Lys）為8個(gè)。

植物乳桿菌HY41 基因編碼產(chǎn)物Pediocin 氨基酸殘基數(shù)量為112個(gè)，分子量為12 993.71 ku，理論等電點(diǎn)為（PI）為6.97，分子式為C579H913N161O175S2，脂肪系數(shù)為82.77，親水系數(shù)為-0.685，不穩(wěn)定系數(shù)為36.73，說明蛋白質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定。帶負(fù)電氨基酸殘基數(shù)（Asp+Glu）為13 個(gè)，帶正電氨基酸殘基數(shù)（Arg+Lys）為13個(gè)，其理論等電點(diǎn)（PI）接近于中性。

2.6.2 跨膜螺旋信號(hào)分析

由表3 及圖8 可知，Pediocin PA 和Pediocin 不存在預(yù)測跨膜區(qū)數(shù)，跨膜螺旋中氨基酸殘基數(shù)小于1，說明植物乳桿菌HY41 所產(chǎn)細(xì)菌素不存在相關(guān)跨膜結(jié)構(gòu)，需借助其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)送至細(xì)胞基質(zhì)外。Ped D 跨膜螺旋中氨基酸殘基數(shù)為112.8162且存在5 個(gè)預(yù)測跨膜區(qū)數(shù)。由此推斷Ped D 在細(xì)菌素轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用，初步推斷植物乳桿菌HY41所產(chǎn)細(xì)菌素由Ped D轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞基質(zhì)，發(fā)揮拮抗有害菌作用。Ped D具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

表3 植物乳桿菌HY41細(xì)菌素相關(guān)基因編碼產(chǎn)物氨基酸跨膜螺旋數(shù)據(jù)Table 3 Analysis of amino acid trans-membrane helix of products encoded by bacteriocin genes in L.plantarum HY41

圖8 lan T基因編碼產(chǎn)物Ped D跨膜螺旋預(yù)測分析Fig.8 Prediction of the transmembrane helixes of lan T gene encoding product Ped D

2.6.3 保守結(jié)構(gòu)域分析

通過Conserved Domain 數(shù)據(jù)庫分析保守結(jié)構(gòu)域，Pediocin PA保守結(jié)構(gòu)域位于21~53個(gè)氨基酸之間，存在Ⅱ類細(xì)菌素超家族結(jié)構(gòu)特征，可通過滲透細(xì)胞膜抑制靶細(xì)胞。Ped D 保守結(jié)構(gòu)域位于13~722個(gè)氨基酸之間，屬于ABC型細(xì)菌素轉(zhuǎn)運(yùn)體，氨基末端結(jié)構(gòu)處理來自細(xì)菌素N末端前導(dǎo)肽，而C末端結(jié)構(gòu)類似于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白膜結(jié)構(gòu)。Pediocin不存在保守結(jié)構(gòu)域。

2.6.4 二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過SOPMA 分析植物乳桿菌HY41 細(xì)菌素相關(guān)基因編碼產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)見表4，結(jié)果表明，Pediocin PA 和Pediocin 結(jié)構(gòu)相似，均以α-螺旋為主，其次為無規(guī)則卷曲，最少為延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角。其中Pediocin 結(jié)構(gòu)中α-螺旋與β-轉(zhuǎn)角比例之和為67.85%，顯著高于Pediocin PAα-螺旋與β-轉(zhuǎn)角比例之和。在二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角比例越高，說明該蛋白質(zhì)穩(wěn)定性越高，因此推斷Pediocin相比Pediocin PA具有較好穩(wěn)定性。

表4 植物乳桿菌HY41細(xì)菌素相關(guān)基因編碼產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Table 4 Analysis of secondary structures of proteins encoded by the bacteriocin-related genes of L.plantarum HY41

通過Swiss Model分析植物乳桿菌HY41細(xì)菌素基因編碼產(chǎn)物三級(jí)結(jié)構(gòu)見圖9，Pediocin PA 三級(jí)結(jié)構(gòu) 與Bacteriocin pediocin PA- 1 M31L（SMTL ID:5ukz.1）同源性最高，兩者序列相似度達(dá)到97.73%。Pediocin 三級(jí)結(jié)構(gòu)與Ped B 晶體結(jié)構(gòu)（SMTL ID：2ip6.1）同源性最高，兩者序列相似度達(dá)100%，Ped B 晶體結(jié)構(gòu)為一種類細(xì)菌素免疫蛋白結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。模型顯示，植物乳桿菌HY41細(xì)菌素基因編碼產(chǎn)物含有大量α-螺旋、無規(guī)則卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符，說明模型可信度較高。

圖9 植物乳桿菌HY41相關(guān)基因編碼產(chǎn)物三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.9 Tertiary structures of proteins encoded by the bacteriocin related genes of L.plantarum HY41

3 討 論

植物乳桿菌HY41產(chǎn)生細(xì)菌素，抵抗食品腐敗菌和病原微生物（金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌），具有廣譜抑菌特性。本研究測定生長曲線發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌HY41 在10~16 h 時(shí)表現(xiàn)最大抑菌活性，此時(shí)處于對(duì)數(shù)期末期與穩(wěn)定期前期之間，與Leroy 等研究結(jié)果一致[15]。植物乳桿菌HY41 細(xì)菌素產(chǎn)生于早期階段，在達(dá)到穩(wěn)定期前抑制病原體，植物乳桿菌HY41生長周期優(yōu)勢(shì)較大。

評(píng)估植物乳桿菌HY41 產(chǎn)生細(xì)菌素在酶、溫度、pH、有機(jī)溶劑和紫外輻照下穩(wěn)定性。植物乳桿菌HY41產(chǎn)生細(xì)菌素在pH＞10時(shí)，易受影響。表明這種細(xì)菌素對(duì)堿性環(huán)境敏感。研究表明，堿性環(huán)境使細(xì)菌素結(jié)構(gòu)遭到破壞，影響抑菌效果[16]。植物乳桿菌HY41 產(chǎn)生細(xì)菌素在121 ℃仍然觀察到抑菌活性。一般乳酸菌細(xì)菌素在121 ℃作用下喪失抑菌活性[17]，證實(shí)植物乳桿菌HY41 具有良好熱穩(wěn)定性。大多數(shù)有機(jī)溶劑測試細(xì)菌素活性不變，而與乙醇混合后抑菌活性略有增大，乙醇單獨(dú)作用滅活部分指示菌，并未增加細(xì)菌素活性。紫外輻照對(duì)細(xì)菌素活性影響不顯著，說明植物乳桿菌HY41所產(chǎn)細(xì)菌素紫外穩(wěn)定性良好。在蛋白酶K、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶作用下，植物乳桿菌HY41不顯示抑菌活性，證實(shí)其蛋白質(zhì)性質(zhì)，利于食品安全。因此該菌株在食品上應(yīng)用潛力較大。

對(duì)植物乳桿菌HY41 開展全基因組測序后作COG 功能注釋發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌HY41 細(xì)胞存在15 個(gè)與次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝（Q: Secondary metabolite biosynthesis, transport and catabolism）相關(guān)基因，占注釋基因總比例0.64%。細(xì)菌素屬于次級(jí)代謝產(chǎn)物，這15 個(gè)基因中存在與細(xì)菌素合成相關(guān)基因。植物乳桿菌WCFS1 已注釋基因COG功能分類中最多三類與本研究不同[18]，說明不同菌種有不同功能側(cè)重，植物乳桿菌HY41側(cè)重于轉(zhuǎn)錄、碳水化合物和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)。在GO注釋結(jié)果中，膜組成部分獲得最多注釋，共626 個(gè)基因，占所有基因比例22.53%，說明植物乳桿菌HY41有較強(qiáng)生物膜形成能力。發(fā)現(xiàn)22個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，占所有基因比例0.79%。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白存在可實(shí)現(xiàn)物質(zhì)與外界交換，將細(xì)菌素釋放到細(xì)胞外部需借助ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。KEGG 功能注釋發(fā)現(xiàn)，整體代謝（476個(gè)基因）、碳水化合物代謝（172個(gè)基因）和氨基酸代謝（135 個(gè)基因）在代謝通路中基因數(shù)量最多。膜運(yùn)輸（128 個(gè)基因）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（68 個(gè)基因）在環(huán)境信息處理過程中基因數(shù)量最多。說明該菌株整體代謝通路情況良好，碳水化合物代謝和氨基酸代謝較強(qiáng)，應(yīng)對(duì)環(huán)境變化能力較強(qiáng)。

植物乳桿菌HY41全基因組測序結(jié)果表明該菌株基因組不包含任何抗生素抗性基因。然而，由于組裝基因組不完全封閉，因此在細(xì)菌基因組未覆蓋區(qū)域中可能存在抗生素抗性基因?？股乜剐砸部赡苁怯梢恍┡c抗性有關(guān)蛋白質(zhì)基因突變所引起[11]。毒力因子一般存在于基因組編碼區(qū)域，在組裝基因組中未檢測到毒力因子，表明植物乳桿菌HY41無典型毒力因子，推斷該菌株不產(chǎn)生毒性物質(zhì)。以上特征表明植物乳桿菌HY41可被認(rèn)為是用于食品工業(yè)的安全培養(yǎng)物，但仍需動(dòng)物試驗(yàn)或臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。全基因組測序分析發(fā)現(xiàn)，該乳酸菌編碼兩種細(xì)菌素——Pediocin PA 和Pediocin。Pediocin PA 可由不同乳酸菌產(chǎn)生[19-20]。Pediocins 和Pediocin PA 均屬于II 類細(xì)菌素，具有熱穩(wěn)定性，與溫度穩(wěn)定性測定結(jié)果相同。

通過Tricine-SDS-PAGE測定植物乳桿菌HY41所產(chǎn)細(xì)菌素分子質(zhì)量。植物乳桿菌HY41所產(chǎn)細(xì)菌素分子質(zhì)量低于5.8 ku。與全基因組測序獲得結(jié)果不一致，推測在細(xì)菌素表達(dá)過程中，可能存在信號(hào)肽或不表達(dá)部分序列，因此測定分子質(zhì)量小于預(yù)測分子質(zhì)量，可進(jìn)一步純化該細(xì)菌素，測定分子質(zhì)量。測定分子質(zhì)量范圍在II 類細(xì)菌素范圍內(nèi)（＜10 ku），該分子質(zhì)量仍有參考價(jià)值。

設(shè)計(jì)特定細(xì)菌素引物，PCR 擴(kuò)增是檢測菌株中細(xì)菌素基因簇是常用方法之一[21]，但無法檢測到新型細(xì)菌素和其他類型細(xì)菌素。對(duì)菌株測序分析全基因組，比對(duì)所有基因組序列，可找出所有產(chǎn)細(xì)菌素基因簇，但無法檢測出新型細(xì)菌素。分析植物乳桿菌HY41細(xì)菌素基因編碼產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，菌株HY41基因組中未出現(xiàn)典型植物乳桿菌素基因，但存在兩種典型Ⅱ類片球菌細(xì)菌素基因簇。在線分析兩種細(xì)菌素基因編碼產(chǎn)物理化性質(zhì)，結(jié)果表明，兩種細(xì)菌素均屬于穩(wěn)定親水性蛋白質(zhì)，與二級(jí)結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)大量α-螺旋有關(guān)。兩種細(xì)菌素均不存在跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，需借助其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白釋放到細(xì)胞外，發(fā)揮生物學(xué)功能。分析兩種細(xì)菌素保守結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)Pediocin PA 存在保守結(jié)構(gòu)域，保守結(jié)構(gòu)域編碼蛋白質(zhì)仍有抑制單增李斯特菌作用的片球菌素。保守結(jié)構(gòu)域作為發(fā)揮主要生物功能的蛋白功能單元具有重要作用不能被改變。兩種細(xì)菌素三級(jí)結(jié)構(gòu)中Pediocin PA 結(jié)構(gòu)與Bacteriocin pediocin PA-1 M31L 最為相近，Bacteriocin pediocin PA-1 M31L 是一種片球菌素[22]，具有抗氧化作用，推測兩者生理功能相同或相似。Pediocin三級(jí)結(jié)構(gòu)與Ped B 晶體結(jié)構(gòu)相似，即一種類片球菌素免疫蛋白[23]，推測Pediocin 具有保護(hù)自身免受細(xì)菌素降解功能。兩種細(xì)菌素具體功能特性還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

植物乳桿菌HY41所產(chǎn)細(xì)菌素在熱、酸堿、紫外和有機(jī)溶劑作用下具有穩(wěn)定性，可抑制單核細(xì)胞增李斯特菌等病原菌和其他食品腐敗菌，全基因組測序分析，植物乳桿菌HY41不含毒力因子和抗生素抗性因子，此外，植物乳桿菌HY41基因組中存在兩種典型II類細(xì)菌素Pediocin PA 和Pediocin基因。植物乳桿菌HY41所產(chǎn)細(xì)菌素對(duì)食源性病原菌抗菌活性和作用機(jī)制，有待進(jìn)一步探究。