李家權(quán)，陳吉敏，楊 悅，楊銀華，趙芳露，周 勱，肖天放，林瑞意

（福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院），福州 350002）

我國擁有豐富的鴨遺傳資源，在自然選擇和人工選擇協(xié)同作用下，地方鴨表型具有多樣性，品種數(shù)目多達35個。我國地方鴨約在2 500年前被馴化[1]，為人類提供各種產(chǎn)品（如肉類、蛋類和羽毛等），在生產(chǎn)生活中發(fā)揮重要作用。金定鴨原產(chǎn)于福建省漳州市龍海區(qū)紫泥鎮(zhèn)金定村，屬于蛋用型地方麻鴨品種，于2000年列入《國家級畜禽品種資源保護名錄》，具有抗病力強、產(chǎn)蛋量多、蛋型大等特點，表現(xiàn)出較強生產(chǎn)性能[2-3]。

在地方品種馴化過程中，以生產(chǎn)為導(dǎo)向的人工選育影響鴨基因組水平變異，特定選擇條件造成新的有利突變在群體中迅速固定和擴大，突變周圍與之連鎖的染色體區(qū)域因搭車效應(yīng)而表現(xiàn)多態(tài)性下降[4]。這種選擇會在物種基因組上留下特殊痕跡，即選擇信號（Selection signature）[5]。在不同群體之間，識別相關(guān)選擇信號的方法是進行遺傳分化系數(shù)（Fst）和核苷酸多樣性比值（π ratio）分析，F(xiàn)st 分析可根據(jù)遺傳信息計算群體間分化程度，π ratio分析則可計算某個位點在兩個亞群間多樣性差異倍數(shù)[6]。結(jié)合兩種分析方法篩選受選擇區(qū)域，可更準確分析多群體之間遺傳分化距離，對于揭示目標群體進化方向具有重要意義。

選擇信號檢測廣泛應(yīng)用于人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，然而對于家畜選擇信號研究仍處于起步階段。李秀領(lǐng)等借助Fst分析對商用大白豬與地方品種通城豬進行全基因組選擇信號檢測，發(fā)現(xiàn)其SNP 位點涉及79 個候選基因，其中NCOA6、ERBB4、RUNX2和APOB等基因與生長繁殖及免疫應(yīng)答有關(guān)[7]。Arora 等對豬進行全基因組測序與選擇性清掃分析發(fā)現(xiàn)與調(diào)節(jié)肌肉途徑相關(guān)候選基因（UGT8、ZGRF1、NDUFA10、EBF3、ELN、UBE2L6、NCALD、MELK、SERP2、GDPD5 和FHL2）[8]。陳建興等利用Fst 和π ratio 檢測山東小毛驢與其他驢群體間選擇信號，共找到39 個受選擇基因，主要在免疫、生殖、細胞作用等通路中發(fā)揮作用[9]。李國輝等發(fā)現(xiàn)與邊雞抗寒、耐缺氧、繁殖力、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和抗逆性等性狀相關(guān)基因（HIF1A、HP1BP3、PTGS2、HSD17B4、PLA2G4A、TNFAIP8）受到選擇[10]。馮佩詩在紹興鴨、山麻鴨和櫻桃谷鴨種群上獲得17 個共同馴化基因，其與心血管發(fā)育、平滑肌增殖、胰島素功能調(diào)控等生理活動密切相關(guān)[11]。張澤賓對2個野鴨群體和7個家鴨群體78只鴨進行全基因組測序發(fā)現(xiàn)，MITF基因影響白羽性狀突變位點；檢測到GRIK2、GRIN3A、PDC、PIK3C3、PNPLA8、PRKAR2B等292 個與馴化相關(guān)基因，大部分參與神經(jīng)發(fā)育、脂肪和能量代謝[1]。

本研究基于全基因組酶切位點的簡化基因組測序（RAD-seq）技術(shù)對4個不同家鴨品種進行選擇信號檢測。采用Fst 和π ratio 值聯(lián)合計算確定受選擇區(qū)域，分別比較金定鴨與連城白鴨、莆田黑鴨、山麻鴨遺傳分化程度和群體間基因組選擇信號，確定受選擇基因，初步探求金定鴨進化方向，為其遺傳資源保護與開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及樣品

選擇金定鴨（JD）、連城白鴨（LC）、莆田黑鴨（PT）和山麻鴨（SM）為研究對象，每個品種各30只，共120只，由國家水禽品種資源基因庫（福建）提供。采集4~6 mL 鴨翅下靜脈血液，置于裝有檸檬酸鈉抗凝管中，-20 ℃冰箱中短暫保存。TIANGEN 血液基因組DNA 提取試劑盒（DP318-03）提取樣品DNA，超微量微孔板分光光度計EPOCH2（BioTek Instruments）和紫外凝膠成像儀（Tanon-2500）檢測DNA質(zhì)量和完整性。

1.2 方法

利用PstⅠ酶酶切基因組DNA，加上P1 接頭，將DNA 隨機打斷成300~700 bp序列，再加上P2接頭，通過PCR 擴增富集RAD tags，在Illumina HiSeqTM2500 測序儀上進行簡化基因組測序，平均測序深度為10×。測序由廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

將下機后原始數(shù)據(jù)運用FASTP軟件[12]進行質(zhì)量控制，應(yīng)用BWA 軟件[13]將質(zhì)控后高質(zhì)量數(shù)據(jù)比對至參考基因組上（GCF_003850225.1），運用GATK軟件[14]檢測SNP，使用SnpEff 軟件[15]注釋SNP 信息（VCF文件）。

1.4 選擇性清除分析

選擇性清除分析可尋找群體受選擇區(qū)域，進一步確定受選擇基因，在分子水平解釋群體進化、馴化背后的適應(yīng)機制。為提高分析準確性，按位點缺失情況過濾原始SNP，得到對應(yīng)SNP及位置信息，缺失率（Missing rate）超過50%標記位點被過濾，過濾后標記用于定位受選擇區(qū)域?；谶^濾后SNP，使用PopGenome 軟件[16-17]，按物理長度進行滑窗，以100 kb 為窗口，10 kb 為步長，將染色體拆分成若干個窗口，分析群體間多樣性。固定指數(shù)（Fixation index），也稱遺傳分化指數(shù)，即Fst，可根據(jù)遺傳信息計算群體間分化程度，其計算公式為：Fst=（MSP-MSG）/[MSP+（n-1）MSG]，其中MSP 和MSG 分別為群體間均方差和群體內(nèi)均方差，n為校正后群體間平均樣本大小。Fst 理論值應(yīng)在0~1 區(qū)間內(nèi)，當Fst=0 時，表示兩個群體之間不存在遺傳分化，F(xiàn)st=1，則兩個群體間分化達到最大。π ratio分析主要關(guān)注某個位點（或區(qū)間）在兩個亞群間多樣性差異倍數(shù)，相比Fst關(guān)注基因型分化，π ratio關(guān)注多樣性值高低。受選擇群體馴化區(qū)段相較于對照群體對應(yīng)區(qū)段，π值更低，兩者比值也越高，π ratio中，分母群體為選擇群體，分子群體為對照群體。

1.5 受選擇區(qū)域篩選及基因富集分析

受選擇區(qū)域篩選可發(fā)現(xiàn)不同家鴨群體基因正向選擇痕跡，從而定位受選擇基因。受選擇區(qū)域一般是群體內(nèi)遺傳多樣性低的染色體區(qū)域，同時也是群體間高遺傳分化率區(qū)域。通過各窗口內(nèi)SNP位點Fst 和π ratio 值評估該染色體區(qū)域是否受選擇。根據(jù)Fst、π ratio 結(jié)果，各自按top 5%篩選兩個品種間基因組區(qū)域，然后將兩個基因組區(qū)域交集定義為選擇信號，并將重疊窗口合并為一段基因組區(qū)域。對篩選出的選擇信號進行基因注釋，識別選擇信號內(nèi)基因，定義為候選基因或受選擇基因。

結(jié)合Fst、π ratio 值獲得受選擇區(qū)域候選基因后，對其進行GO 和KEGG 富集分析，了解基因功能，為進一步篩選驗證提供線索。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP檢測結(jié)果

從4個家鴨品種中平均檢測到140萬個SNPs位點，其中金定鴨1 366 205 個，連城白鴨1 297 124個，莆田黑鴨1 655 626 個，山麻鴨1 661 924 個，根據(jù)SNPs 位置信息利用R 包VennDiagram 繪制韋恩圖（見圖1）。由結(jié)果可知，金定鴨與連城白鴨群體之間，共享848 976 個SNPs 位點，金定鴨特有517 229 個；與莆田黑鴨相比，共享1 042 950 個SNPs位點，特有323 255個，與山麻鴨相比，共享1 017 557個SNPs位點，特有348 648個。

圖1 兩兩群體間用于分析的SNP數(shù)目Fig.1 Number of SNP used for analysis between pairs of populations

2.2 群體間受選擇區(qū)域篩選

基于過濾后SNP，按滑動窗口方法，分別計算金定鴨、連城白鴨、莆田黑鴨和山麻鴨各窗口內(nèi)Fst 和π ratio，根據(jù)top 5%確定Fst、π ratio 的閾值（見表1）以篩選受選擇區(qū)域。在金定鴨和連城白鴨兩個品種間，將Fst值大于0.44且π ratio值大于2.37基因組區(qū)域交集為兩個鴨群體間選擇信號（見圖2A），這些選擇信號位于染色體1-15、18、20、21、24、25、28和Z上，并在其中找到349個候選基因。根據(jù)表1中閾值，以相同方法，確定金定鴨與莆田黑鴨選擇信號（見圖2B），受選擇染色體為1-14、16、18、19、21、22、28、29和Z，注釋到185個候選基因；金定鴨與山麻鴨選擇信號（見圖2C），受選擇染色體為1-14、16、18、19、21、22、24、29 和Z，注釋到316 個候選基因。進一步篩選全部候選基因，發(fā)現(xiàn)有17個候選基因同時出現(xiàn)在3個比較組中（見圖3），分別是ADAMTSL1、AFAP1L2、CCDC186、Cntln、DEPDC1B、DIMT1、ELOVL7、IPO11、KIF2A、LRRC70、PDE4D、RAB3C、SH3GL2、STARD4、Tdrd1、VWA2、ZNF462。

圖2 群體間選擇信號示意圖Fig.2 Schematic of selection signatures between poputions

圖3 受選擇基因韋恩圖Fig.3 Venn diagram of selected genes

表1 選擇清除各指標閾值Table 1 Thresholds of indicators for selective sweep

2.3 受選擇基因GO和KEGG分析

對候選基因進行GO功能富集分析，富集條目及基因數(shù)見圖4。在金定鴨和連城白鴨組349個候選基因中，有140 個基因顯著富集于324 個GO 條目（P＜0.05），其中包括10 條細胞組分類，29 條分子功能類和285條生物過程類，主要集中在受體結(jié)合、運輸、對刺激反應(yīng)調(diào)節(jié)、細胞過程負調(diào)控、生物質(zhì)量調(diào)節(jié)等過程。金定鴨與莆田黑鴨組（見圖4B）185 個候選基因中，有96 個基因顯著富集于199個GO條目，其中包括10條細胞組分類，23條分子功能類和166條生物過程類，主要集中在微管細胞骨架、蛋白質(zhì)二聚活動、細胞代謝過程等。金定鴨與山麻鴨組（見圖4C）316個候選基因中，有158 個基因顯著富集于167 個GO 條目，其中包括13 條細胞組分類，38 條分子功能類和116 條生物過程類，主要富集在細胞器、轉(zhuǎn)移酶活性、分子功能調(diào)節(jié)、氮化合物代謝過程等。

圖4 GO富集分析聚類圖Fig.4 Gene ontology(GO)enrichment analysis of candidate genes

對候選基因進行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，金定鴨比對連城白鴨、莆田黑鴨、山麻鴨受選擇基因參與主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分別有223條、129條和251條。其中，金定鴨與連城白鴨比較組中顯著富集通路有20條（P＜0.05），涉及81個候選基因，從中找到14個可能與金定鴨重要經(jīng)濟性狀相關(guān)功能基因，主要參與核黃素新陳代謝、PI3K-Akt信號通路、糖鞘脂生物合成等，包括AGPAT4、Akt3、DGK、GADD45G、HEXB、PIP5K、PLPP1、PRKAA、ST3GAL1、SKP2、SYK、FBXL1、AMPK、HSPA8。金定鴨與莆田黑鴨比較組中顯著富集通路有6條，涉及17個候選基因，找到2個功能基因，主要參與淀粉和蔗糖代謝等通路，為ENPP1_3、FSHB。金定鴨與山麻鴨比較組中顯著富集通路有14 條，涉及47 個候選基因，有8 個可能涉及重要經(jīng)濟性狀，主要集中在沙門氏菌感染、癌癥中轉(zhuǎn)錄失調(diào)、趨化因子信號通路等，為CCL4、CCL5、MAP2K1、GADD45、CXCL8、IL8、MEK1、PLOK。除此之外，對P 值作校正處理得到q值，挑選q值前20 通路，繪制氣泡圖（見圖5）。

圖5 KEGG富集分析氣泡圖Fig.5 KEGG enrichment analysis of candidate genes

3 討論與結(jié)論

遺傳分化由長期自然選擇和人工選擇造成，受群體交配、地域歷史和基因流等因素影響。Wright認為當Fst＞0.25時表明群體間遺傳分化程度較大[18]。本研究中，群體間Fst 值均大于0.25，說明金定鴨與連城白鴨、莆田黑鴨、山麻鴨間遺傳出現(xiàn)高度分化。金定鴨是我國優(yōu)秀地方蛋鴨品種，與其他3個地方品種相比，因受選擇強度和方向不同，金定鴨在外貌特征、生產(chǎn)性能等方面均與其他地方品種存在差異。通過對金定鴨與其他3個地方群體之間選擇信號檢測，尋找與金定鴨重要經(jīng)濟性狀相關(guān)的受選擇基因。

與連城白鴨相比，金定鴨體型大且產(chǎn)蛋量高。Akt3 基因編碼絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（蛋白激酶B）是PI3K-Akt 信號通路中重要基因，具有促進細胞增殖和調(diào)控細胞代謝等功能，與肌肉發(fā)育存在密切聯(lián)系。王利娜研究發(fā)現(xiàn)，該基因正向調(diào)控家兔骨骼肌增殖發(fā)育，是影響生長速度重要基因[19]；陳亞楠認為其參與調(diào)控大白豬肌肉發(fā)育過程且對脂肪沉積有影響[20]；張榮萍檢測到Akt在鴨胚后期高度表達，調(diào)控胸肌和腿肌發(fā)育[21]。研究發(fā)現(xiàn)該基因于多條通路中顯著富集，提示金定鴨可能在肌肉生長發(fā)育過程受到選擇。生長停滯和DNA損傷誘導(dǎo)基因（GADD45G）是GADD45家族成員，通常在胎盤中高度表達，與動物生殖密切相關(guān)。Liu等認為GADD45G基因可能是提高母豬產(chǎn)仔數(shù)的有用候選基因，暗示金定鴨在產(chǎn)蛋性能上受選擇[22]。HSPA8 基因是熱休克蛋白70 家族成員，該家族包含熱誘導(dǎo)和組成表達的成員，Shigehisa等從珍珠雞中鑒定出熱休克蛋白（HSP）70 家族3 個基因同源體，其中HSPA8 禽同源基因為NmHSPA8[23]；熱休克蛋白可在高溫環(huán)境時保護機體免受損傷，該基因受強烈選擇，與金定鴨具有較強耐熱特性一致，可能與適應(yīng)野外放養(yǎng)高溫環(huán)境有關(guān)。PLPP1是研究人員近年確定的一類中性脂肪代謝調(diào)控關(guān)鍵基因，該基因編碼蛋白質(zhì)是磷脂酸磷酸酶（PAP）家族成員中3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸（PAPs），將磷脂酸轉(zhuǎn)化為甘油二酯，并在甘油合成和磷脂酶D介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用，這種酶與水解和吸收胞外脂肪有關(guān)[24]，與之功能相近基因還有AGPAT4、DGK。與連城白鴨相比，金定鴨可能在肌肉生長發(fā)育、產(chǎn)蛋性能、熱應(yīng)激和脂肪代謝等方面受到選擇。

金定鴨與莆田黑鴨組顯著富集候選基因中，ENPP1_3、FSHB可能對重要經(jīng)濟性狀有影響。ENPP1_3是外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶（ENPP）家族成員，編碼一種II 型跨膜糖蛋白，Trapero 等發(fā)現(xiàn)ENPP1 是子宮內(nèi)膜異位癥候選生物標志物[25]；Boggavarapu 等證實ENPP3 對孕激素具有調(diào)節(jié)作用[26]。FSHB基因編碼促卵泡素β亞基，可誘導(dǎo)卵子和精子產(chǎn)生，Liu 等發(fā)現(xiàn)FSHB基因可促進北京鴨和黑番鴨產(chǎn)蛋，與GADD45G基因功能相近[27]。這些基因在金定鴨中受到選擇，可能與其產(chǎn)蛋量性狀相關(guān)。此外，試驗發(fā)現(xiàn)在與莆田黑鴨比較中，篩選到受選擇功能基因較少，因兩者群體間遺傳分化指數(shù)相對較小，金定鴨與莆田黑鴨可能具有更近血緣。

在篩選金定鴨和山麻鴨候選基因時發(fā)現(xiàn)，受選擇基因（CCL4、CCL5、IL8等）大多與免疫功能有關(guān)，提示金定鴨在抗病性狀上受強烈選擇。CCL4、CCL5 同屬于CC 趨化因子家族，參與動物免疫調(diào)節(jié)和炎癥過程，F(xiàn)arhanah等研究發(fā)現(xiàn)，強毒力傳染性法氏囊病病毒（vvIBDV）感染雞，其機體CCL4、CCL5等免疫基因表達均上調(diào)[28]。IL8基因編碼CXC 趨化因子家族成員，是炎癥反應(yīng)主要介質(zhì)，編碼蛋白質(zhì)通常稱為白細胞介素8；Kaiser 等發(fā)現(xiàn)雞體內(nèi)IL8的同源基因為9E3[29]；Ronan 等認為細菌入侵時IL8基因在機體腸道高表達是固有的免疫反應(yīng)，在預(yù)防疾病中發(fā)揮重要作用[30]。

在3組顯著富集功能基因中，并未發(fā)現(xiàn)選擇清除分析中受重復(fù)選擇的基因，表明受重復(fù)選擇基因可能不直接參與功能通路對機體調(diào)控，具體作用方式和分子機制還需進一步研究。

綜上所述，本研究采用簡化基因組測序手段檢測金定鴨選擇信號。通過3組分析，分別注釋得到349、185、316 個候選基因，其中有17 個落入重疊選擇信號區(qū)域。在候選基因功能顯著性富集分析中，功能基因提示金定鴨在產(chǎn)蛋性能、肌肉生長發(fā)育、免疫、熱應(yīng)激、脂肪代謝等方面受選擇。研究結(jié)果將有助于金定鴨表型變異遺傳剖析，并指示其進化方向。