張貴學(xué)，李曉宇，黃富碩，馬銘鈞，王子銘，馮 瑞，李玉龍，許鐘峯，鄭 鵬

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

微囊藻毒素（Microcystin，MC）作為一種由水華爆發(fā)時(shí)微囊藻屬等藍(lán)藻產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物[1]，已成為廣泛存在于水體的有害物質(zhì)。其中，變異體MC-LR（L，R 分別代表亮氨酸和精氨酸）分布最廣，毒性最強(qiáng)[2]。近年來對(duì)MC-LR 研究日益深入，發(fā)現(xiàn)其對(duì)動(dòng)物肝、腎臟、神經(jīng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)均具有毒性[3-4]。Campos 等研究表明，MC-LR 可通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（OATP）承載進(jìn)入細(xì)胞[5]，動(dòng)物肝臟中存在OATP家族成員，是MC-LR 主要靶器官。向小鼠腹腔內(nèi)注射用同位素標(biāo)記的MC-LR 后，不僅在肝臟中檢測(cè)到MC-LR 大量積累，且腎臟中也有分布[6]。此外，MC-LR 也可通過OATP 進(jìn)入小鼠腦細(xì)胞，誘導(dǎo)小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞（HT-22 細(xì)胞）產(chǎn)生氧化應(yīng)激，引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡[7]。近年報(bào)道表明，MC-LR可減少淋巴細(xì)胞增殖，改變吞噬細(xì)胞（Phagocyte）和自然殺傷細(xì)胞（Natural killer cell，NK）等活性，干擾細(xì)胞因子合成等多種機(jī)制改變免疫系統(tǒng)，對(duì)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響[8]。MC-LR 除上述毒性外，對(duì)雌性動(dòng)物生殖系統(tǒng)也有毒性。Zhang等研究MCLR 對(duì)體外中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞影響發(fā)現(xiàn)，MC-LR可顯著抑制CHO細(xì)胞體外增殖，MC-LR處理的CHO細(xì)胞顯示強(qiáng)烈細(xì)胞周期停滯及凋亡誘導(dǎo)作用；此外，將CHO 細(xì)胞暴露于MC-LR 導(dǎo)致過量活性氧生成和細(xì)胞內(nèi)鈣釋放，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERs），同時(shí)自噬泡也大量積累[9]。Wu 將MC-LR以200 μg·kg-1劑量注射雌性小鼠腹腔內(nèi)，連續(xù)28 d飼養(yǎng)，表明MC-LR 注射組小鼠卵巢重量較正常組下降，發(fā)情期和發(fā)情期持續(xù)時(shí)間減少，孕酮水平顯著降低[10]。盡管之前有MC 對(duì)母畜生殖系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用的研究，但大多數(shù)集中在卵巢，關(guān)于MC對(duì)母畜子宮影響的研究卻鮮見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在通過用MC-LR 體外處理牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞（Bovine endometrial epithelial cells，BEECs），探究其對(duì)細(xì)胞活率影響及分子調(diào)控機(jī)制，為后續(xù)提高奶牛繁殖效率相關(guān)研究提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞購自廣州華拓生物科技有限公司（Otwo Biotech）。

1.2 主要試劑

EMEM 培養(yǎng)基（購自美國Gibco 公司）；胎牛血清（Pansera ES）（購自德國Pan Seratech 公司）；PBS（P1010）、SDS-PAGE 電泳液（購自Solarbo 公司）；胰蛋白酶、胰酶細(xì)胞消化液、1.5 mol·L-1Tris-HCl（pH=8.8）、1.0 mol·L-1Tris-HCl（pH=6.8）、ECL 發(fā)光底物試劑盒、四甲基乙二胺（TEMED）和雙抗均（購自奧淇洛譜（biosharp）公司）、微囊藻毒素（MC-LR）（購自MedChemExpress 公司）；β-actin、Caspase-3、Caspase-9 抗體以及其二抗均（購自博奧森（Bioss）公司）；Trizol、PCR試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均（購自日本TaKaRa公司）；TAE電泳液（購自納川生物技術(shù)公司）；瓊脂糖（購自Biowest 公司）；引物由上海生工生物科技公司合成；q-PCR 試劑盒FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）（購自Roche 公司）；Cell counting kit-8（CCK-8）（購自美國Bimake 公司）；凋亡免疫熒光試劑盒（購自Beyotime Biotechnology 公司）；流式測(cè)細(xì)胞周期試劑盒（購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）；流式測(cè)細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 BEECs的培養(yǎng)

①細(xì)胞傳代：參照詹同彤等方法[11]，將培養(yǎng)瓶中細(xì)胞轉(zhuǎn)移到大皿中培養(yǎng)，待皿中細(xì)胞匯合到80%~90%時(shí)，用移液器吸出培養(yǎng)液，選擇3 mL 1×PBS 清洗皿表面，加入4 mL 胰酶細(xì)胞消化液，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中消化3~4 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞，待細(xì)胞變圓、漂浮后加入等體積培養(yǎng)液終止消化，用移液器輕輕吹打，將混合液移入10 mL離心管，用1 000 r·min-1離心機(jī)離心4 min，離心完畢后立即傾倒上清，然后向離心管中加入2 mL 培養(yǎng)液，吹打均勻后，分別移至兩個(gè)中皿，再向兩個(gè)中皿分別加入2 mL 培養(yǎng)液，細(xì)胞繼續(xù)生長。待貼壁細(xì)胞數(shù)量達(dá)到80%~90%時(shí)，再次傳代。

②細(xì)胞凍存和復(fù)蘇：待細(xì)胞傳至2~3 代時(shí)，凍存部分細(xì)胞供后續(xù)試驗(yàn)使用。按照細(xì)胞傳代步驟至離心完畢傾倒上清后，向離心管中加入凍存液，待管中細(xì)胞充分溶解于凍存液后，移至2 mL凍存管中，用封口膜將凍存管口封好，放入4 ℃預(yù)冷30 min，-20 ℃中停留2 h，-80 ℃凍存柜中過夜。第二天將凍存柜中細(xì)胞移入液氮（-196 ℃）中長期保存。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，從液氮中取出凍存細(xì)胞，迅速放入37~38 ℃水浴鍋中解凍，待凍存管中液體融化后，用移液槍將液體移至離心管中，1 000 r·min-1離心機(jī)離心3 min，棄上清后加入培養(yǎng)液溶解，溶解后將液體移入中皿，加適量培養(yǎng)液稀釋，置于5%CO2箱，37 ℃，飽和濕度培養(yǎng)。

1.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率

將細(xì)胞傳至3~4代后，移至96孔板，培養(yǎng)24 h后，移液槍吸走上清，加入新培養(yǎng)液，分為10組，分 別 用0、40、60、80、100、120、140、160、180、200 μg·L-1的MC-LR 處理細(xì)胞，培養(yǎng)12、24 h 后，加入CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，之后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率

待細(xì)胞傳至3~4代，用160 μg·L-1MC-LR處理細(xì)胞24 h，培養(yǎng)至處理時(shí)間后棄掉培養(yǎng)液，用2 mL 1×PBS 清洗，用不含EDTA 的胰酶消化細(xì)胞，待皿中細(xì)胞被消化漂浮起來后收集細(xì)胞，用1 000 r·min-1、4 ℃離心機(jī)離心5 min，棄上清。預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，均在1 000 r·min-1、4 ℃條件下離心5 min，棄上清。然后加入100 μL 1×Binding Buffer，輕輕吹勻直至成為單細(xì)胞懸液。之后加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI Staining Solution，輕輕吹勻；避光、室溫（20~25℃）孵育10 min；最后加入400 μL 1×Binding Buffer，輕輕混勻。染色后樣品在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

收集用100 μg·L-1的MC-LR 處理12 h 后細(xì)胞（2×105~1×106個(gè)），離心棄上清，用1×PBS 洗滌一次，離心棄上清。然后加入1 mL DNA Staining solution 和10 μL Permeabilization solution 旋渦振蕩5~10 s混勻。室溫避光孵育30 min。選擇最低點(diǎn)上樣速度，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。

1.7 RT-qPCR檢測(cè)基因mRNA表達(dá)

收集不同處理?xiàng)l件下細(xì)胞后，使用Trizol 提取RNA，紫外分光光度法測(cè)定其濃度和純度。當(dāng)OD260/OD280比值在1.8~2.0，認(rèn)為樣品合格。之后用TaKaRa 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。待反轉(zhuǎn)錄完成后，再按照試劑盒步驟進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。其中引物見表1，擴(kuò)增完畢后，以β-actin 為參照，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算各基因mRNA表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.8 Western blot 測(cè)定Pi3k、Akt、Caspase-9 和Caspase-3蛋白表達(dá)

收集經(jīng)不同方案處理細(xì)胞后，用RIPA 裂解細(xì)胞獲得蛋白。BCA 法確定蛋白濃度后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺電泳。之后轉(zhuǎn)膜，脫脂乳封閉，4 ℃一抗孵育過夜，16 h后TBST清洗三次后室溫孵育二抗，孵育完畢后再用TBST 清洗三次，清洗后加ECL 顯色液曝光。以β-actin 為參照，使用Image J軟件分析光密度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)表示為平均值（Means）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD），使用SPSS 20.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，單因素方差分析LSD 法檢驗(yàn)顯著性，使用GraphPad Prism 8 軟件制圖，*表示差異顯著（P＜0.05），**表示差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 CCK-8檢測(cè)不同濃度及時(shí)間處理后細(xì)胞存活率變化

CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率，結(jié)果見圖1，12 h處理組，MC-LR 處理后細(xì)胞存活率增加；24 h 處理組，MC-LR 處理后細(xì)胞存活率降低。根據(jù)已有結(jié)果選取12 h 100 μg·L-1（P＜0.01），24 h 160 μg·L-1（P＜0.01）兩種方案作后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 不同濃度、不同時(shí)間MC-LR處理對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effects of MC-LR treatment at different concentrations and different times on cell viability

2.2 100 μg·L-1 MC-LR處理細(xì)胞12 h的影響

2.2.1 100 μg·L-1MC-LR 處理細(xì)胞12 h 后對(duì)Pi3k信號(hào)通路的影響

qPCR 檢 測(cè)Pi3k、Akt、mTOR等mRNA 表 達(dá)量，結(jié)果見圖2，與對(duì)照組相比，上述基因mRNA表達(dá)極顯著上升（P＜0.01），表明使用100 μg·L-1MC-LR 處理細(xì)胞12 h 促 進(jìn)Pi3k，Akt和mTOR的mRNA表達(dá)。此條件對(duì)Pi3k和Akt蛋白表達(dá)的影響見圖3A，使用100 μg·L-1MC-LR 處理細(xì)胞12 h，Pi3k（110 ku）和Akt（56 ku）蛋白表達(dá)量均顯著上升，其中Pi3k 蛋白表達(dá)量見圖3B，表達(dá)量極顯著上升（P＜0.01），Akt蛋白表達(dá)量見圖3C，表達(dá)量顯著上升（P＜0.05），與qPCR結(jié)果趨勢(shì)一致。此試驗(yàn)結(jié)果表明用100 μg·L-1MC-LR處理細(xì)胞12 h，可強(qiáng)化Pi3k-Akt-mTOR通路導(dǎo)致細(xì)胞增殖。

圖2 12 h 100 μg·L-1處理對(duì)Pi3k信號(hào)通路基因的影響Fig.2 Effects of 12 h 100 μg·L-1 treatment on Pi3k signal pathway genes

圖3 12 h 100 μg·L-1處理對(duì)Pi3k及Akt蛋白的影響Fig.3 Effects of 12 h 100 μg·L-1 treatment on Pi3k and Akt protein

2.2.2 100 μg·L-1MC-LR 處理細(xì)胞12 h 后對(duì)線粒體凋亡通路的影響

100 μg·L-1MC-LR 處理細(xì)胞12 h 細(xì)胞線粒體凋亡通路相關(guān)基因mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量變化見圖4，其中Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3的mRNA 表達(dá)量與對(duì)照組相比均極顯著下降（P＜0.01）；蛋白表達(dá)量條帶結(jié)果見圖5A，Caspase-9（35 ku）和Caspase-3（28 ku）表達(dá)均下降，Caspase-9蛋白表達(dá)結(jié)果見圖5B，表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），Caspase-3蛋白表達(dá)結(jié)果見圖5C，表達(dá)量極顯著下降（P＜0.01）。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，使用100 μg·L-1MC-LR處理細(xì)胞12 h，細(xì)胞線粒體凋亡通路被抑制，導(dǎo)致凋亡細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞數(shù)量增加。

圖4 12 h 100 μg·L-1處理對(duì)線粒體凋亡通路基因mRNA的影響Fig.4 Effects of 12 h 100 μg·L-1 treatment on the mRNA of mitochondrial apoptosis pathway genes

圖5 12 h 100 μg·L-1處理對(duì)Caspase-3和Caspase-9蛋白的影響Fig.5 Effects of 12 h 100 μg·L-1 treatment on Caspase-3 and Caspase-9 proteins

2.2.3 100 μg·L-1MC-LR處理細(xì)胞12 h對(duì)細(xì)胞周期的影響

100 μg·L-1MC-LR處理細(xì)胞12 h，細(xì)胞周期發(fā)生變化見圖6A，處理后處于G0/G1 期細(xì)胞比例減少，G2/M期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例增加，且根據(jù)圖6B結(jié)果，其變化均呈極顯著趨勢(shì)（P＜0.01）。結(jié)果表明，100 μg·L-1MC-LR處理細(xì)胞12 h后，細(xì)胞處于G2/M期比例增加，有助于細(xì)胞增殖。

圖6 12 h 100 μg·L-1處理對(duì)細(xì)胞周期的影響Fig.6 Effects of 12 h 100 μg·L-1 treatment on cell cycle

2.2.4 100 μg·L-1MC-LR處理細(xì)胞12 h后對(duì)p53基因mRNA表達(dá)的影響

100 μg·L-1MC-LR 處理細(xì)胞12 hp53 基因mRNA相對(duì)表達(dá)量變化如圖7所示，p53基因mRNA表達(dá)量顯著上升（P＜0.05）。

圖7 12 h 100 μg·L-1處理對(duì)p53基因mRNA表達(dá)量的影響Fig.7 Effects of 12 h 100 μg·L-1 treatment on the expression of p53 gene mRNA

2.3 160 μg·L-1 MC-LR處理細(xì)胞24 h的影響

2.3.1 160 μg·L-1MC-LR處理細(xì)胞24 h后染色情況

160 μg·L-1MC-LR 處理細(xì)胞24 h 引起細(xì)胞變化結(jié)果如圖8所示，染為綠色的為凋亡細(xì)胞，染為紅色的為壞死細(xì)胞，其中黑色箭頭指的是被綠色單染的凋亡細(xì)胞，白色箭頭指示被綠色和紅色雙染的壞死細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)分析表明160 μg·L-1MC-LR處理細(xì)胞24 h，引起細(xì)胞凋亡，且發(fā)現(xiàn)因凋亡死亡細(xì)胞數(shù)量大于壞死細(xì)胞數(shù)量。

圖8 24 h 160 μg·L-1處理后細(xì)胞染色結(jié)果Fig.8 Cell staining results after 24 h 160 μg·L-1 treatment

2.3.2 160 μg·L-1MC-LR處理細(xì)胞24 h后對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

為進(jìn)一步探究160 μg·L-1MC-LR 處理細(xì)胞24 h對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)處理后細(xì)胞凋亡變化，結(jié)果如圖9A 所示，細(xì)胞發(fā)生凋亡，且大部分凋亡細(xì)胞處于凋亡早期階段。凋亡率如圖9B 所示，與對(duì)照組相比，表達(dá)量極顯著上升（P＜0.01）。

圖9 24 h 160 μg·L-1處理對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響Fig.9 Effects of 24 h 160 μg·L-1 treatment on cell apoptosis rate

2.3.3 160 μg·L-1MC-LR 處理細(xì)胞24 h 后對(duì)線粒體凋亡通路的影響

檢測(cè)160 μg·L-1MC-LR 處理細(xì)胞24 h 線粒體凋亡途徑主要基因變化見圖10、11。圖10 表明，160 μg·L-1MC-LR 處理細(xì)胞24 h后與對(duì)照組相比，Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3、Bax/Bcl-2 基 因mRNA 相對(duì)表達(dá)量均上升，其中Cyt-c與Caspase-9顯著升高（P＜0.05），Caspase-3、Bax/Bcl-2極顯著升高（P＜0.01）。圖11A蛋白條帶結(jié)果顯示，160 μg·L-1MC-LR 處理細(xì)胞24 h，與對(duì)照組相比，Caspase-9（35 ku）和Caspase-3（28 ku）蛋白表達(dá)量均升高，其中Caspase-9 表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），Caspase-3表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01），見圖11B、11C。基因mRNA和蛋白表達(dá)趨勢(shì)一致，試驗(yàn)表明，160 μg·L-1MC-LR處理細(xì)胞24 h，強(qiáng)化線粒體凋亡通路，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖10 24 h 160 μg·L-1處理對(duì)對(duì)線粒體凋亡通路基因mRNA的影響Fig.10 Effects of 24 h 160 μg·L-1 treatment on mitochondrial apoptosis pathway gene mRNA

圖11 24 h 160 μg·L-1處理對(duì)Caspase-9及Caspase-3蛋白的影響Fig.11 Effects of 24 h 160 μg·L-1 treatment on Caspase-9 and Caspase-3 protein

3 討 論

3.1 MC-LR處理對(duì)Pi3k通路的影響

研究證明Pi3k-Akt-mTOR 信號(hào)通路與細(xì)胞增殖聯(lián)系密切[5-6]，細(xì)胞接收外界刺激后，可通過磷脂酰肌醇三激酶（Pi3k）誘發(fā)三磷酸（3,4,5）磷脂酰肌醇（PIP3）生成，生成的PIP3 可作為具有普列克底物蛋白同源性（PH）結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)膜停泊位點(diǎn)，與Akt 及其上游激活劑PDK1結(jié)合[7]。當(dāng)Akt 通過其普列克底物蛋白同源（PH）結(jié)構(gòu)域與PIP3 結(jié)合后，導(dǎo)致Akt 轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜，通過雙磷酸化機(jī)制激活A(yù)kt。同理，自身PH 結(jié)構(gòu)域而轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜的PDK1 激活A(yù)kt 蘇氨酸308 位點(diǎn)使其磷酸化。此外，mTORC2 可激活A(yù)kt 絲氨酸473 位點(diǎn)使Akt 酶活性被完全激活[8-10]。Pi3k 相關(guān)激酶（Pikk）家族成員，包括DNA-PK 也同樣在Akt 絲氨酸473 位點(diǎn)將其磷酸化[7]。被激活的Akt 導(dǎo)致大量下游底物磷酸化，包括共有序列RXRXXS/T，其主要功能之一是調(diào)控mTOR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)細(xì)胞生長與蛋白質(zhì)合成，從而達(dá)到細(xì)胞增殖目的[12-13]。本試驗(yàn)使用100 μg·L-1MC-LR 處理細(xì)胞12 h，Pi3k和Akt的mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)，mTOR的mRNNA 表達(dá)量顯著上調(diào)，證明此處理?xiàng)l件可激活細(xì)胞內(nèi)Pi3k-Akt-mTOR 信號(hào)通路，引起細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量增加。

3.2 MC-LR處理對(duì)線粒體凋亡通路的影響

線粒體是生命體中必不可少的一部分，主要參與ATP 合成，為細(xì)胞各種生命活動(dòng)提供能量。Hers 等研究發(fā)現(xiàn)，線粒體在細(xì)胞凋亡過程中也扮演重要角色[14]。當(dāng)細(xì)胞受到輻射、缺氧、毒素等外界應(yīng)激時(shí)，線粒體外膜通透性（MOMP）發(fā)生改變，導(dǎo)致線粒體膜空間蛋白（尤其是細(xì)胞色素c）釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活胱天蛋白酶。胱天蛋白酶一旦被激活，裂解數(shù)百種蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞快速死亡，且這些死亡細(xì)胞具有獨(dú)特生化和形態(tài)特征[15]。在線粒體ATP生成過程中，細(xì)胞色素c可在電子傳輸鏈的配合物Ⅲ和Ⅳ之間穿梭電子，但進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)后，就會(huì)在三磷酸腺苷（ATP）作用下與銜接蛋白凋亡酶激活因子（aPoPtotic Protease activating factor-1，APaf-1）結(jié)合，導(dǎo)致APaf-1 發(fā)生別構(gòu)效應(yīng)被激活[16]。APaf-1上有和Caspase-9同源的Caspase激活與募集結(jié)合域（CRAD），所以激活后APaf-1 會(huì)與Cyt-c、Caspase-9結(jié)合形成凋亡小體，且在其形成過程中完成對(duì)Caspase-9的募集和激活。激活后的Caspase-9會(huì)進(jìn)一步激活其下游信號(hào)分子Caspase-3啟動(dòng)凋亡程序，最終引起細(xì)胞凋亡[17-19]。本試驗(yàn)中，使用100 μg·L-1MC-LR 處理細(xì)胞12 h 后抑制基 因Cyt-c、Caspase-9 和Caspase-3 的mRNA 以及Caspase-9和Caspase-3蛋白表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。這種抑制作用可能是通過Cyt-c間接抑制線粒體下游途徑[20-21]，也可能通過ATPase結(jié)構(gòu)域直接和APaf-1 結(jié)合，阻礙ProcasPase-9 募集，抑制Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞免受Caspase-3 誘導(dǎo)表達(dá)[22]。而用160 μg·L-1MC-LR處理細(xì)胞24 h后促進(jìn)Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3、Bax/Bcl-2 基 因mRNA 和Caspase-9、Caspase-3 蛋白表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。

3.3 MC-LR處理對(duì)細(xì)胞周期及基因p53的影響

細(xì)胞周期變化直接影響細(xì)胞數(shù)量變化，通過對(duì)S 期細(xì)胞比率（S-Phase fraction，SPF）和增殖指數(shù)（Proliferous index，PI）計(jì)算可了解細(xì)胞增殖能力[23]。計(jì)算公式為SPF=S/（G0/1+S+G2/M）×100%，PI=（S+G2/M）/（G0/1+S+G2/M）×100%。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，經(jīng)12 h 100 μg·L-1MC-LR 處理后細(xì)胞處于G0/G1 期數(shù)量顯著下降，處于G2/M和S期細(xì)胞數(shù)量顯著增加，SPF和PI值均增大，表明此處理?xiàng)l件使細(xì)胞周期發(fā)生變化，促使細(xì)胞發(fā)生增殖效應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量增多。

試驗(yàn)結(jié)果表明，用100 μg·L-1MC-LR 處理細(xì)胞12 h 后，細(xì)胞可通過Pi3k-Akt-mTOR 通路獲得持續(xù)增殖信號(hào)，并且阻滯線粒體通路程序性細(xì)胞凋亡，此現(xiàn)象具有“腫瘤表征”，所以處理后導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)癌變趨勢(shì)。p53基因作為抑癌基因，在抑制細(xì)胞癌變方面扮演重要角色。在細(xì)胞周期中，p53 調(diào)節(jié)功能主要體現(xiàn)在G1 和G2/M 期監(jiān)測(cè)校正點(diǎn)，與轉(zhuǎn)錄激活作用密切相關(guān)。p53 還可通過與p21 和GADD45結(jié)合形成復(fù)合物，利用自身3'~5'核酸外切酶活性，在DNA 修復(fù)中發(fā)揮作用。正常情況下，p53 基因?qū)?xì)胞周期有“減慢或監(jiān)視”作用。細(xì)胞中抑制癌變的基因p53 可判斷DNA 變異程度，如變異程度較小，p53促使細(xì)胞自我修復(fù)，使其發(fā)揮正常功能。若DNA 變異較大，p53 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24]。本試驗(yàn)檢測(cè)p53 基因在用100 μg·L-1MC-LR處理12 h 條件下mRNA 相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示其相對(duì)表達(dá)量顯著上升，因此認(rèn)為該處理使細(xì)胞發(fā)生變異，但因變異程度較小而未產(chǎn)生凋亡效果。

4 結(jié) 論

綜上所述，100 μg·L-1MC-LR 處理細(xì)胞12 h，細(xì)胞通過增強(qiáng)Pi3k-Akt-mTOR 信號(hào)通路和抑制線粒體凋亡通路促進(jìn)細(xì)胞增殖，導(dǎo)致處于G1期細(xì)胞數(shù)量減少，G2/M 和S 期細(xì)胞數(shù)量增加；160 μg·L-1MC-LR 處理細(xì)胞24 h，細(xì)胞通過活化線粒體凋亡通路發(fā)生凋亡。