閆 雷，孫小賀，李 威，曲娟娟，孟慶堯，張鈺瑩，武志民，蘇 捷

（東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，哈爾濱 150030）

隨著城市化發(fā)展，工業(yè)“三廢”、污水灌溉農(nóng)田以及農(nóng)藥和化肥大量使用導致土壤重金屬污染日趨嚴重。目前我國農(nóng)田土壤重金屬污染以鎘、砷、汞、鉛、銅及其復合污染較為嚴重，其中以鎘超標最為突出[1]。重金屬鎘通過土壤進入植物，導致植物各器官產(chǎn)生毒害，抑制植物光合作用，影響植物生長發(fā)育，致使作物減產(chǎn)。不僅如此，鎘易被植物吸收并且從根系轉(zhuǎn)移至地上部，通過食物鏈傳遞危害動物及人體健康[2]。鑒于此，減少重金屬對植物危害、保障蔬菜安全生產(chǎn)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中亟待解決的問題[3]。

植物激素是植物細胞接受特定環(huán)境信號誘導產(chǎn)生、在低濃度時可調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的活性有機物[4]。植物激素在植物防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，是介導植物脅迫反應(yīng)關(guān)鍵內(nèi)源因子[5]。多種植物激素被發(fā)現(xiàn)可促進鎘脅迫下植物生長發(fā)育。褪黑素預處理緩解鎘對苜蓿幼苗生長抑制作用[6]，外源水楊酸通過增加光合色素和礦質(zhì)元素減少浮萍鎘積累[7]。因此，推測外源激素可減緩重金屬脅迫對植物的損傷。油菜素甾醇類物質(zhì)（Brassinosteroid，BR）是植物中最早發(fā)現(xiàn)的一類甾醇類激素[8]，表油菜素內(nèi)酯（EBL）作為BR高活性合成類似物，具有調(diào)節(jié)細胞伸長與分裂，調(diào)控植物種子及根部發(fā)育，調(diào)節(jié)植物光周期、光合作用，提高果實產(chǎn)量和品質(zhì)等作用[9]。外源EBL已被證實可緩解植物高溫、低溫、鹽、光照和干旱等方面脅迫，EBL刺激酶促和非酶促抗氧化劑生產(chǎn)系統(tǒng)，促進抗氧化防御系統(tǒng)、光合作用、激素穩(wěn)態(tài)以及增加滲透液和大量營養(yǎng)素積累[10-12]。EBL 具有協(xié)助植物在逆境環(huán)境下修復的潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與處理

供試黃瓜品種為“津春9號”。選用顆粒飽滿黃瓜種子經(jīng)10%過氧化氫溶液消毒，將種子洗凈后播種至全蛭石育苗盤，待黃瓜幼苗長至兩葉一心時采用水培法，將黃瓜幼苗移至裝有700 mL 全Hoagland營養(yǎng)液黑色塑料盆中，每盆6株，置于人工氣候箱中培養(yǎng)（晝/夜16 h/8 h，溫度26 ℃/20 ℃，光照強度10 000 lx/0 lx，相對濕度65%），共培養(yǎng)3 周。期間每2 d 更換一次營養(yǎng)液，選取長勢一致幼苗開展后續(xù)試驗。根據(jù)預試驗結(jié)果確定試驗濃度并設(shè)置3 個處理：T1：鎘濃度為0 μmol·L-1，葉面噴施去離子水；T2：鎘濃度為100 μmol·L-1，葉面噴施去離子水；T3：鎘濃度為100 μmol·L-1，葉面噴施0.5 μmol·L-1EBL，每組處理設(shè)置3 個平行。其中鎘以CdCl2·2.5H2O形式加入營養(yǎng)液中，每日16:00 葉面噴施EBL 連續(xù)3 d，噴至葉面有水珠滴落為止。分別在鎘處理2、4、6 d測定地上部和根部鎘含量、光合葉綠素熒光相關(guān)參數(shù)，鎘處理6 d測定MDA含量、抗氧化酶活性及觀察葉片超微結(jié)構(gòu)，每個試驗處理3次重復。

1.2 生物量、株高、根長和Cd含量測定

黃瓜根系采用25 mmol·L-1Na2-EDTA溶液浸泡15 min，去除表面吸附的鎘離子[14]。清洗后測量黃瓜幼苗株高、根長并記錄鮮重，105 ℃殺青15 min，70 ℃烘干至恒重，記錄干重。將干燥樣品制成粉末狀，根據(jù)GB 5009.15-2004 方法用HNO3/HClO4混合物（9/1，V/V）消化處理，砂浴鍋（DK-2）于160 ℃加熱消解，火焰原子吸收光譜儀（AAS；ZEEnit700P/650P，Analytik-Jena，Germany）測定鎘含量。

1.3 葉綠素含量和光合參數(shù)測定

采用丙酮-乙醇浸提法測定黃瓜葉綠素含量，根據(jù)張憲政方法計算[15]。

GFS-3000 光合作用-熒光測量系統(tǒng)（WALZ，Germany）于9:00~11:00 測定植物頂端第一片完全展開葉凈光合速率（Pn）、胞間CO2濃度（Ci）、氣孔導度（Gs）及蒸騰速率（Tr）。

1.4 快速葉綠素熒光誘導動力學曲線測定與分析

葉片經(jīng)暗適應(yīng)30 min 后，使用手持葉綠素熒光儀（Handy PEA，Hansatech，UK）于10:00~11:00測定黃瓜葉片（從頂端計數(shù)第一片葉子）OJIP 曲線。根據(jù)Strasser 和李鵬民等方法計算JIP-test 參數(shù)[16-17]，具體參數(shù)及含義見表1。

表1 快速葉綠素熒光誘導動力學曲線（OJIP）分析中使用的參數(shù)和公式Table 1 Parameters and formulas used in the analysis of rapid chlorophyll fluorescence induction kinetic curve(OJIP)

1.5 MDA和抗氧化酶測定

分別取0.5 g 新鮮葉片和根系在預冷條件下磷酸緩沖液（pH 7.8）研磨，在4 ℃，12 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液測定。丙二醛（MDA）采用硫代巴比妥酸（TBA）法；超氧化物歧化酶（SOD）采用氮藍四唑（NBT）還原法；過氧化物酶（POD）采用愈創(chuàng)木酚法[18]；過氧化氫酶（CAT）使用南京建成生物有限公司試劑盒測定。

1.6 葉片超微結(jié)構(gòu)觀察

將黃瓜葉片切成3 cm×1 cm條狀，2.5%戊二醛溶液中前固定，抽真空后用pH為6.8磷酸緩沖液將樣品沖洗3 次，1%鋨酸后固定。磷酸緩沖液沖洗后分別用濃度為50%、70%、90%乙醇脫水，最后用100%乙醇脫水，浸透包埋后，超薄切片機切成50~60 nm 切片，切片經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后，透射電鏡（JEOLTEM-1230EX，日本）觀察拍照。

1.7 統(tǒng)計處理與分析

采用Origin8.5 繪圖，SPSS 22.0 軟件處理數(shù)據(jù)，采用One-Way ANOVA作統(tǒng)計分析，Duncan法分析顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）差異性，結(jié)果用“平均值±標準誤差”表示。

2)流程改造后入選細度的大幅增加，大幅改善選別指標，在精礦品位差別不大的情況下，精礦產(chǎn)率提高6.62個百分點，回收率提高12.61個百分點，每年經(jīng)濟效益增加2 053.73萬元/a。本研究成果在昆鋼集團內(nèi)部建立了混合鐵礦的磨選示范工程，并對公司內(nèi)部及國內(nèi)類似礦山混合鐵礦選廠提供可借鑒的實踐經(jīng)驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 EBL對鎘脅迫下黃瓜植株生長的影響

T1 對照組隨時間增加，植物鮮重、干重、株高、根長均呈逐漸上升趨勢；T2 鎘處理組植物隨處理時間增加長勢較緩（見圖1），表明鎘處理對植物生長有抑制作用。T3 與T2處理相比，可不同程度提高植物株高、根長、鮮重、干重，處理6 d時差異顯著，株高、根長、鮮重、干重分別較T2處理組升高10.75%、22.68%、16.84%、12.50%，說明葉面噴施EBL 可減輕鎘對植物生長的抑制作用。

圖1 EBL對鎘脅迫下黃瓜幼苗鮮重、干重、株高、根長和表型圖的影響Fig.1 Effects of EBL on fresh weight,dry weight,plant height,root length and phenotype of cucumber seedlings under cadmium stress

2.2 EBL對鎘脅迫下黃瓜植株鎘含量的影響

由圖2可知，鎘脅迫使植物地上部及根部積累大量鎘，且隨處理天數(shù)增加呈遞增趨勢，表明植物受鎘脅迫時間越長，植物鎘積累量越大。處理2 d后，T3處理顯著抑制植物地上部鎘積累，根部鎘含量顯著上升；處理4 d后，植物地上部和根部鎘含量分別較T2鎘處理降低22.78%和43.36%，呈極顯著抑制作用；處理6 d后，T3處理顯著降低植物地上部和根部鎘含量，但抑制程度下降。

圖2 EBL對鎘脅迫下黃瓜幼苗地上部和根部鎘含量的影響Fig.2 Effects of EBL on cadmium content in shoot and root of cucumber seedlings under cadmium stress

2.3 EBL 對鎘脅迫下黃瓜植株葉綠素含量和光合系統(tǒng)的影響

由表2 可見，處理后第2天，T2處理組黃瓜葉片葉綠素a 和總?cè)~綠素含量顯著降低，T3 處理鎘脅迫下葉綠素a和總?cè)~綠素含量顯著增加，分別增加6.21%和4.06%。處理后第4 天，T2 處理導致葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量呈不同程度降低，與T1 對照相比分別減少30.64%、8.77%、5.22%；而T3處理組葉綠素a和總?cè)~綠素含量顯著上升，與T2處理相比分別增加12.41%、8.99%。處理后第6天，T2處理組黃瓜葉片葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量顯著降低，且降幅較大，經(jīng)T3處理后大幅上升。由表2可看出，隨鎘處理時間增加，植物葉綠素含量受鎘影響越大。葉面噴施EBL顯著提高鎘脅迫下黃瓜葉片葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素含量，且隨鎘處理時間增加呈上升趨勢。

表2 EBL對鎘脅迫下黃瓜幼苗葉綠素含量的影響Table 2 Effects of EBL on chlorophyll contents of cucumber seedlings under cadmium stress

由圖3可知，處理2、4、6 d后T2鎘處理組黃瓜葉片Pn、Tr和Gs顯著降低，但第2、6天Ci顯著提高。鎘脅迫第2 天，T3 處理組黃瓜葉片Pn、Tr、Gs 和Ci 與T2 相比差異顯著，分別升高63.58%、83.66%、87.74%和6.57%。處理后第4天，T3 處理顯著提高鎘脅迫下黃瓜葉片Pn、Tr、Gs 和Ci，分別提高46.13%、40.65%、42.64%、6.44%。處理后第6 天，T2 處理使植物Pn 和Tr 分別較T1 下降76.32%、66.83%，Ci 較T1 升高8.75%。T3 處理顯著提高黃瓜葉片Pn 和Tr，對植物Gs無顯著影響，Ci則顯著下降。

圖3 不同處理下黃瓜葉片凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導度（Gs）和胞間二氧化碳濃度（Ci）變化Fig.3 Changes of net photosynthetic rate(Pn),transpiration rate(Tr),stomatal conductance(Gs)and intercellular carbon dioxide concentration(Ci)of cucumber leaves under different treatments

2.4 EBL對鎘脅迫下黃瓜植株OJIP曲線和熒光參數(shù)的影響

2.4.1 EBL對葉片OJIP曲線的影響

與T1 對照處理相比，鎘脅迫使不同處理天數(shù)下黃瓜葉片OJIP曲線發(fā)生形變，I相（30 ms）和P相（Fm）大幅降低。不同處理天數(shù)下，T3處理使植株I相（30 ms）和P相（Fm）較T2鎘處理明顯上升。T3處理在鎘脅迫2 d 時J-P 期曲線上升幅度最大，隨處理時間增加，J-P 期曲線增幅降低（見圖4）。不同處理天數(shù)下T2 處理Fo 值高于T1 處理，T3 處理較T2處理下降，但差異不顯著。

a、b、c分別表示鎘脅迫2、4和6 d。a,b,c represent 2,4 and 6 d of cadmium stress,respectively.

2.4.2 EBL對葉片PSⅡ反應(yīng)中心的影響

Fv/Fm是可變熒光和最大熒光比值，反映PSⅡ反應(yīng)中心最大光化學效率。不同天數(shù)下T2 鎘處理顯著降低黃瓜葉片F(xiàn)v/Fm，隨處理時間增加呈先增后降趨勢（見表3）。T3 處理則顯著增加鎘脅迫下Fv/Fm值，隨時間變化趨勢與T2處理一致。PIABS是基于光能吸收的性能指標，可準確反應(yīng)植物光合機構(gòu)性能狀態(tài)。T2 處理顯著降低不同處理天數(shù)黃瓜葉片PIABS值，T3 處理下PIABS值高于T2 處理，但僅鎘處理2 d時差異顯著。

表3 EBL對黃瓜葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響Table 3 Effects of EBL on chlorophyll fluorescence parameters of cucumber leaves

2.5 EBL 對鎘脅迫下黃瓜植株MDA 和抗氧化酶活性的影響

由上述結(jié)果可知，鎘脅迫6 d 時黃瓜在噴施EBL 后變化顯著，故針對鎘脅迫6 d植株測定MDA含量、抗氧化酶活性及觀察分析葉片超微結(jié)構(gòu)。

MDA 是評價植物膜脂過氧化程度指標。T2 鎘處理組黃瓜葉片及根系MDA 含量顯著增加，分別較T1對照處理提高47.97%、50.82%。T3處理組植物葉片及根系在鎘脅迫下MDA含量與T1對照相比顯著升高，分別提高46.59%、45.92%，T3 處理與T2處理相比，葉片及根系MDA含量下降但無顯著差異，表明EBL 可適當降低鎘脅迫下黃瓜膜脂過氧化程度（見圖5a）。如圖5b~d所示，T2鎘處理顯著降低黃瓜葉片及根系SOD、CAT 活性，增強POD 活性，其中葉片SOD、CAT 活性與T1 對照處理相比分別降低28.80%、19.57%，POD 活性增加26.85%，根系SOD、CAT 活性與T1 處理相比分別降低19.29%、27.78%，POD 活性增加38.17%。T3處理組黃瓜葉片SOD、CAT 活性較T2 處理分別增加11.70%、11.90%，POD 活性降低5.92%，黃瓜根系POD、CAT 活性較T2 處理分別增加3.68%、23.53%，SOD活性增加但未見顯著差異。

圖5 EBL對鎘脅迫下黃瓜葉片和根系MDA含量和抗氧化酶活性的影響Fig.5 Effects of EBL on MDA content and antioxidant enzyme activity in cucumber leaves and roots under cadmium stress

2.6 EBL對鎘脅迫下黃瓜葉片超微結(jié)構(gòu)的影響

黃瓜葉片經(jīng)不同處理后超微結(jié)構(gòu)如圖6 所示。T1 處理，黃瓜葉片葉綠體呈飽滿梭狀，葉綠體未見明顯腫脹，可見清晰類囊體膜，嗜鋨顆粒較多。T2 處理導致細胞葉綠體形變，界膜不清晰，淀粉粒多且體積大，類囊體膜模糊不清，嗜鋨顆粒較多，且較大；線粒體受損，結(jié)構(gòu)模糊。T3 處理，葉綠體腫脹變形，類囊體膜較清晰，大基粒朵疊較弱，多為基質(zhì)片層；嗜鋨顆粒相對較少，線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

圖6 不同處理下黃瓜葉片透射電子顯微鏡圖片（×8000倍）Fig.6 Transmission electron microscope pictures of cucumber leaves under different treatments(×8000 times)

3 討 論

植物受重金屬脅迫導致大量活性氧自由基產(chǎn)生，攻擊細胞膜不飽和脂肪酸，導致細胞膜透性增加，抑制植物細胞正常分裂，降低葉片活力，影響植物光合和呼吸作用，損傷細胞結(jié)構(gòu)[19-20]。馮建鵬等發(fā)現(xiàn)高濃度鎘導致黃瓜葉綠素合成受阻、降解加速，抑制植物葉片光合作用；PSII系統(tǒng)受到損傷，誘導黃瓜葉片SOD、CAT、G-POD 和APX等抗氧化酶活性降低，抑制植株生長[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫抑制黃瓜生長發(fā)育，生物量、株高和根長明顯下降，地上部和根部鎘含量增加；噴施EBL后增加黃瓜在鎘脅迫下株高、根長、鮮重和干重，鎘處理第2、4、6天地上部和根部鎘含量顯著降低。與陸曉民等在葉面噴施EBL 通過提高黃瓜幼苗葉片抗氧化酶活性、降低MDA 含量及細胞膜透性，有效緩解光合速率下降，提高氯化鈉脅迫下黃瓜幼苗鮮質(zhì)量及地下部干質(zhì)量促進幼苗生長研究結(jié)果相近[22]。Nazir等研究表明，BRs維持銅脅迫下番茄形態(tài)和生理生化特性[23]。在銅脅迫條件下，葉面添加EBL 顯著提高光合效率、氣孔運動、根系形態(tài)、細胞活力、葉綠體超微結(jié)構(gòu)完整性，促進植物根和地上部對Ca2+、K+、Fe2+和Mg2+吸收，降低地上部和根部銅積累，最終促進番茄生長。Xie等證實EBL 可通過刺激抗氧化酶和減少金屬吸收降低莧菜鎘含量[24]。因此推測EBL可能通過促進其他離子吸收和維持離子穩(wěn)態(tài)減少鎘積累，緩解鎘脅迫對黃瓜生長的抑制作用，有待進一步深入研究。

有關(guān)油菜素內(nèi)酯研究表明，EBL通過提高植物抗氧化酶活性減少活性氧過度累積、減輕膜脂過氧化作用，穩(wěn)定細胞膜結(jié)構(gòu)與功能，防止葉綠素降解，提高其光合性能，使植物可應(yīng)對生物或非生物環(huán)境脅迫[25-26]。本研究也顯示，鎘脅迫下黃瓜葉片和根系MDA 含量、過氧化物酶（POD）活性上升，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性顯著下降。與單獨鎘處理相比，葉面噴施EBL黃瓜SOD、POD、CAT 活性顯著上升，MDA 含量降低。與Ghassemi-Golezani 等在黑芥菜上研究結(jié)果一致[27]。Li等發(fā)現(xiàn)外源EBL降低水分脅迫下文冠果MDA 和活性氧含量，增加葉片含水量，提高抗氧化酶活性，最終促進幼苗生長[28]。張盛楠等證明，外源施用EBL 可通過增加水稻根部和地上部POD 和CAT 活性減輕膜脂過氧化程度，降低鎘對水稻的毒害作用[29]。表明外源EBL通過誘導抗氧化物酶活性提高黃瓜抗氧化能力，清除植物體內(nèi)產(chǎn)生的過量活性氧降低膜脂過氧化程度，從而緩解Cd毒害作用。

光合作用是生物體將光能轉(zhuǎn)化為化學能的過程，是自然界中最重要化學反應(yīng)之一。逆境條件影響光合作用，且不同植物、不同環(huán)境脅迫中光合障礙機理不同[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫對黃瓜葉綠素含量、光合氣體交換參數(shù)、細胞膜結(jié)構(gòu)以及葉綠素熒光產(chǎn)生不利影響。這種影響可能是由于PSII 系統(tǒng)QA-到QB 電子傳遞過程受阻，阻礙葉綠素生物合成，破壞葉肉組織，光合酶可行性降低，葉片氣孔數(shù)量和尺寸減少并影響CO2吸收[19]。吳秀等研究顯示油菜素內(nèi)酯可通過增強活性氧的清除、調(diào)節(jié)內(nèi)源多胺含量變化，降低不利環(huán)境對光合器官造成的傷害[31]。Dong等研究發(fā)現(xiàn)油菜素內(nèi)酯應(yīng)用可增加大豆葉綠素含量，維持較高光能轉(zhuǎn)化潛力，緩解鋁脅迫對PSII 原初光化學反應(yīng)及光合機構(gòu)狀態(tài)和結(jié)構(gòu)的破壞[32]。Peng等研究表明鎘影響龍葵正常生長，葉面噴施EBL 可通過提高光合色素含量改善光合性能、降低氧化損傷等，減輕鎘對龍葵幼苗生長抑制效應(yīng)[33]。因此，EBL可通過調(diào)節(jié)光合作用提高植物對重金屬脅迫耐性。本研究也發(fā)現(xiàn)，與單獨鎘處理相比，葉面噴施EBL 黃瓜葉綠素含量、Pn、Tr、Gs、Fv/Fm、PIABS顯著上升，OJIP曲線在J-P期較鎘處理明顯升高，細胞膜結(jié)構(gòu)較為完整。表明EBL 通過對PSII 反應(yīng)中心產(chǎn)生保護作用，減輕鎘脅迫對黃瓜葉片的損傷[34]。在光合時間相同條件下，葉面噴施EBL 顯著提高鎘脅迫下黃瓜幼苗光合性能，有助于增強植物耐鎘能力，但隨鎘處理時間增加呈降低趨勢，說明EBL效應(yīng)期較短，實際應(yīng)用應(yīng)注意補施。

綜上，葉面噴施EBL 能夠緩解重金屬鎘脅迫，后續(xù)將從分子生物學角度進一步研究緩解機制。

4 結(jié) 論

100 μmol·L-1鎘脅迫降低黃瓜幼苗抗氧化酶活性，加劇膜脂過氧化程度，破壞類囊體膜結(jié)構(gòu)，抑制其光合作用，降低生物量，增加鎘積累量。葉面噴施0.5 μmol·L-1EBL 有助于維持鎘脅迫下黃瓜幼苗葉綠體正常功能，通過提高抗氧化酶活性、清除體內(nèi)過量活性氧，減輕細胞膜脂過氧化程度，保護PSII反應(yīng)中心，提高光合色素含量和凈光合速率從而提高光合性能，減輕鎘積累、減弱鎘毒害，維持黃瓜幼苗正常生長發(fā)育。