郝愛玲，曲云淼，張 祺，李孝娟，金 金，潘麗娜，趙一丹，于達恒，張 宇

（1.黑龍江省畜牧總站，哈爾濱 150069；2.廣東省汕尾市農業(yè)科學院，廣東 汕尾 516600）

家畜精液冷凍保存技術研究主要始于20世紀50年代，C.Polge等用甘油作冷凍保護劑，使牛、羊等許多哺乳動物的精液得以成功冷凍保存。但豬精液冷凍保存技術研究進展比較緩慢，采用豬冷凍精液進行人工授精的比例尚不足1%。生產上對豬精液冷凍技術的研究一直沒有突破性進展，直到最近幾年才在豬精液稀釋液、解凍液、冷凍保護劑及凍精劑型等方面取得了一些研究成果，但對冷凍-解凍機制方面尚不十分清楚，還處于探索階段。目前豬冷凍精液的應用比例仍然較低，主要用于種質資源保存及種豬場引種等。與其他家畜精子相比，豬精子不抗凍，對低溫和冷凍都很敏感，在冷凍和解凍過程中更易受到損傷；解凍后精子復蘇率較低，異常精子多，受胎率和產仔率低。由于豬精子對溫度非常敏感，即使稀釋液中加入了適當?shù)谋Ｗo劑并在適當?shù)臏囟认吕鋬?，也必須使用適當?shù)慕鈨龇椒ú拍鼙ＷC解凍后的精子活力。適宜的解凍方法可以使精子快速通過精子冷凍的危險溫度區(qū)，減少精子細胞的損傷。目前國內外對豬精液的冷凍方法研究得比較多，但對解凍方法和解凍程序研究得還不夠深入。為此，本試驗采用兩種解凍方法對豬細管凍精進行解凍，檢測了精子活力、生存時間和頂體完整率，試圖找到更合適的豬精液解凍方法，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 凍精樣品

豬細管冷凍精液，購自河南某公司。包括長白、大白、杜洛克三個品種20頭份凍精，每頭份4支，共計80支凍精。凍精規(guī)格為0.5 mL／支。

1.2 主要設備及器材

帶有加溫裝置的相差顯微鏡（型號為OLYMPUS BX41），購自奧林巴斯（北京）銷售服務有限公司；數(shù)顯式恒溫水浴鍋（型號為HH·W21·420，溫度控制在±0.1℃）3臺、移液器（Eppendorf、0.5～10.0μL）1個、秒表3塊、大鑷子2把、溫度計（0～100℃）3支、試管架、試管、毛巾、10μL槍頭、載玻片、蓋玻片、剪刀（細管凍精專用）、記號筆、血球計數(shù)器等，市購。以上設備及器材均由黑龍江省畜牧總站家畜凍精檢測實驗室提供。

1.3 主要試劑

豬凍精解凍稀釋液，購自河南某公司（與豬細管冷凍精液來源一致）；吉姆薩（Giemsa）染液、固定液、香柏油等，市購。

2 方法

2.1 試驗準備

2.1.1 解凍稀釋液的制備 將稀釋粉按照說明加入純化水，充分溶解后分裝在2個三角燒瓶中，分別放到38℃和30℃恒溫水浴鍋中，備用。

2.1.2 校準水浴鍋溫度 試驗前將實驗室溫度控制在25℃左右。分別取3支經權威部門檢定過的溫度計，對3個恒溫水浴鍋進行校準，1號水浴鍋校準至38℃，2號校準至50℃，3號校準至30℃。

2.1.3 器材準備及顯微鏡預熱 提前準備好大鑷子、剪刀等器材，并打開顯微鏡加溫板提前預熱。

2.2 豬冷凍精液的解凍

將豬冷凍精液分成2組，每組20頭份40支，1組為38℃水浴直接解凍30 s，2組為50℃水浴解凍16 s后再放到30℃水浴中靜止40 s。

1組：從液氮罐中抽取同一號碼的2支0.5 mL細管凍精，迅速放入38℃恒溫水浴鍋內，同時按下秒表；用鑷子夾住細管在水中擺動幾下，30 s后用鑷子取出細管；用毛巾擦干，剪開超聲波封口端，用精液杵棒杵棉塞端將精液杵進試管中，并逐步加入稀釋液進行稀釋，搖勻后用移液器取樣，鏡檢。

2組：取2支和第一種解凍方法相同號碼的凍精，迅速放入50℃恒溫水浴鍋內，同時按下秒表；16 s后放入30℃恒溫水浴鍋中，靜置40 s后取出；后續(xù)操作同第一種方法。

2.3 豬冷凍精液解凍后的質量檢測

2.3.1 凍后精子活力檢查 首先檢查相差顯微鏡加溫板溫度是否達到37℃，用移液器吸取10μL稀釋搖勻后的精液，滴在載玻片上；蓋上蓋玻片，在200倍顯微鏡下選擇不同視野觀察前進運動的精子百分數(shù)，并調整相差顯微鏡觀察不同層次的精子運動情況，多觀察幾個視野全面評定精子活力。對兩種解凍方法解凍的精液分別進行活力檢測并做好記錄。1組和2組分別檢測20頭份豬冷凍精液樣品。2.3.2 生存時間檢查 將檢查完活力的精液做好標記，繼續(xù)放置在37℃恒溫水浴鍋中保存，分別在1，2，3，4 h后再檢查活力。這項指標主要用來檢查解凍后精子的生存能力，即觀察精子在一定環(huán)境條件下維生命活動的時間，一般以37℃環(huán)境條件下保存，4 h內的精子活力來驗證。

2.3.3 頂體完整率檢查 制片：解凍后的精液用移液器吸取10μL滴在載玻片一端，用凹玻片利用拖片法將精液均勻拖布于載玻片上，制成均勻的精液抹片，自然干燥；用40%甲醛固定液固定，15 min后用清水沖去固定液，吹干或自然風干；用吉姆薩染液染色90 min，再用清水緩緩沖去染液，自然干燥后鏡檢。將兩種方法解凍的精液分別制作頂體片，并用記號筆做好標記。

鏡檢：先用低倍鏡找到精子密度適中的視野，再轉到1 000倍油鏡下仔細觀察。頂體形態(tài)基本分為正常（頂體部分著色均勻、頂脊明顯）、輕度膨脹（頂脊部分染色深淺不一、頂脊消失）、嚴重膨脹（頂體邊緣膨大呈冠狀）、頂體脫落（頂體部分脫落或全部脫落、細胞核裸露）。根據(jù)上述精子頂體形態(tài)分類仔細觀察每個視野的精子形態(tài)，每張片子共檢查300個精子，計算頂體完整精子所占百分數(shù)，即為頂體完整率。

2.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行配對檢驗。

3 結果與分析

3.1 不同解凍方法對解凍后精子活力的影響

分別將凍精在38℃水浴直接解凍30 s（1組）、50℃水浴解凍16 s后再放到30℃水浴中靜置40 s（2組），結果表明，解凍后2組精子活力極顯著高于1組（＜0.01），見表1。

表1 采用不同解凍方法解凍后的精子活力測定結果Tab.1 Determination of sperm motility after thawing by different thawing methods

3.2 不同解凍方法對精子生存時間的影響

兩組凍精解凍后精子活力下降速度都很快，1 h后已經有近50%檢測樣品精子活力降至0.10以下，3 h后60%以上樣品精子活力降為0，4 h后兩組精子活力幾乎全部為0，各時間點組間均差異不顯著（＞0.05）。

3.3 不同解凍方法對精子頂體完整率和頂體形態(tài)的影響

兩組凍精解凍后，2組精子頂體完整率極顯著高于1組（＜0.01），見表2。

表2 采用不同解凍方法解凍后的精子頂體完整率測定結果Tab.2 Determination of sperm acrosome integrity rate after thawing by different thawing methods

檢測過程中發(fā)現(xiàn)頂體膨脹、頂體脫落的數(shù)量都很多，見圖1和圖2；而且1組比2組頂體損傷更為嚴重。

圖1 精子頂體損傷情況Fig.1 The damage of sperm acrosome

圖2 精子頂體膨脹情況Fig.2 The damage of sperm acrosome

4 討論

與冷凍過程一樣，精子在解凍時也必須快速越過-5 ～-25℃危險溫度區(qū)，以免低溫對精子造成損傷。為減少物理損傷和溶解效應，解凍時要快速通過危險溫區(qū)，盡量減少在危險溫區(qū)的時間，只有采用合適的解凍溫度和方法才能保證精子的復蘇率。合適的解凍溫度使冷凍精子能夠快速越過危險溫度區(qū)，從玻璃化狀態(tài)轉變?yōu)橐簯B(tài)，減少對精子的傷害。因此，解凍溫度和解凍方法是影響凍后精子復活和頂體再次損傷的重要因素。

頂體完整率是影響受胎率的重要因素，而且受胎率的高低與頂體完整率呈強正相關。由于精子頭部頂體中至少存在著幾種與受精有關的酶，因此精子頂體完整對于受精是至關重要的。在冷凍和解凍過程中均有可能造成精子頂體的損傷，解凍時溫度由低溫到高溫也是造成頂體損傷的一個重要因素。精子頂體損傷可能主要是由解凍時的快速升溫所致。

豬冷凍精液技術還不夠成熟，有些技術還處于研究探索階段，也包括解凍溫度和方法。牛冷凍精液的精子活力在很大程度上取決于冷凍精液的解凍溫度。關于牛冷凍精液的解凍技術方面已經有很成熟的經驗，牛冷凍精液國家標準規(guī)定解凍溫度是37℃。但豬精子有別于牛精子，其中有豬精液本身性質的問題，豬精子中含有較多的脂肪顆粒，容易受溫度變化的影響，另外也有豬精液精清中一些重要物質缺失的原因，無論是冷凍過程還是解凍過程精子都容易受到傷害，需要通過試驗研究找出適合的解凍方法，其中解凍溫度和解凍時間都是關鍵環(huán)節(jié)。如果解凍速度過快，豬精液很可能解凍不完全，從而影響豬精子的活力。賈蘭萍等認為，牛細管凍精的解凍時間過短不利于精子復蘇，但解凍時間過長精液中釋放的酶量過多、精子活力會迅速下降。因此，在豬凍精應用研究中需要找出合適的解凍溫度和解凍時間以保證解凍后的精液品質。

解凍后不能只看精子活力，還要看生存時間，生存時間是影響受胎率的重要因素。對于牛冷凍精液高溫（45℃）解凍，精子活力較高但生存時間較低；低溫（36℃）解凍，精子活力較差但生存時間較長。本試驗中，所有凍精樣品生存時間均較短，這可能是豬精液冷凍過程中某環(huán)節(jié)處理不當造成的，如稀釋液、平衡時間、冷凍程序等方面的原因；也可能是該批次凍精自身的原因，其他項目組反饋本批次凍精用于人工授精試驗的受胎率很低。具體原因還需要在其他試驗中繼續(xù)觀察、驗證。

5 結論

與38℃慢速解凍冷凍精液相比，50℃快速解凍的豬細管冷凍精液的精子活力好而且頂體完整率高。