宋天園，肖 蘭，王 甜，夏建珍，魯碧楠，唐 麗*

（1.民族醫(yī)藥教育部重點實驗室（中央民族大學(xué)），北京 100081；2.中央民族大學(xué) 藥學(xué)院，北京 100081；3.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 護理學(xué)院，北京 100144；4.中央民族大學(xué) 附屬校醫(yī)院，北京 100081）

過敏性疾病是一類變態(tài)反應(yīng)性常見病與多發(fā)病，呈現(xiàn)出全球高發(fā)的趨勢，嚴重影響人們的健康與生活質(zhì)量，被世界衛(wèi)生組織列為21世紀重點防治的三大疾病之一。已有大量研究表明，致敏性樹木和草本的花粉是重要的變應(yīng)原之一。隨著現(xiàn)代社會城市化建設(shè)迅速發(fā)展，城市綠地建設(shè)和生態(tài)環(huán)境改善的同時，植物種類及種植區(qū)域拓展，植物花粉變應(yīng)原也隨之增加，致敏植物花粉 飄散于空氣中，是季節(jié)性鼻炎、結(jié)膜炎、哮喘的觸發(fā)因素，也是特應(yīng)性皮炎的加重因素，近年來全球范圍內(nèi)花粉致敏引發(fā)的各類變態(tài)反應(yīng)疾病呈現(xiàn)逐年高發(fā)態(tài)勢。因此，對花粉誘發(fā)的變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病機制、變應(yīng)原檢測、有效治療及其防控等的探索研究需求日益迫切，花粉過敏動物模型的構(gòu)建是其中的一個關(guān)鍵因素和環(huán)節(jié)。依據(jù)2013年世界變態(tài)反應(yīng)組織白皮書，全球過敏性疾病的患病率為10% ～40%，其中有過敏性鼻炎患者4億人和支氣管哮喘患者3億人，開展花粉致敏相關(guān)基礎(chǔ)和應(yīng)用研究對保護人類健康、提高人們生活質(zhì)量具有重要意義。

文章圍繞近年來國內(nèi)外文獻報道的花粉過敏動物試驗研究，分別從花粉致敏模型動物品系種類、模型構(gòu)建方法、繁育策略、檢測與評價指標等方面進行整理分析，闡述與評價各類動物模型及其構(gòu)建方法和特點，旨在為花粉過敏動物模型研究的深入開展提供可能的技術(shù)參考、為花粉過敏機制研究與有效治療及藥物發(fā)現(xiàn)提供一點啟發(fā)。

1 花粉過敏的類型及其主要發(fā)生機制

花粉過敏可引起多種臨床癥狀，花粉變應(yīng)原可誘發(fā)季節(jié)性過敏性鼻炎、過敏性哮喘、過敏性結(jié)膜炎及皮炎等變態(tài)反應(yīng)性疾病，通常主要涉及呼吸系統(tǒng)，出現(xiàn)鼻塞、鼻癢、打噴噴、大量流清水樣鼻涕、咽部不適等癥狀，嚴重可誘發(fā)哮喘，有時非常嚴重甚至危及生命。

花粉過敏的發(fā)生機制復(fù)雜，雖然對引起主要病理變化的免疫機制已有所了解，但其免疫病理反應(yīng)的具體啟始途徑等環(huán)節(jié)尚未完全闡明?；ǚ圻^敏是由接觸變應(yīng)原花粉而引發(fā)的變態(tài)反應(yīng)，在花粉過敏患者血清中同時可檢測到特異性IgE和IgG，其中以由IgE介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)（即速發(fā)型超敏反應(yīng)）為主。易感者接觸花粉變應(yīng)原后產(chǎn)生免疫反應(yīng)，肥大細胞和嗜堿性粒細胞發(fā)生脫顆?，F(xiàn)象，生成過量的IgE，并激活釋放一系列炎性介質(zhì)，引發(fā)各種過敏反應(yīng)，致敏機制涉及嗜酸性粒細胞浸潤、肥大細胞脫顆粒、抗原特異性IgE產(chǎn)生、Th細胞活化、Th1／Th2失衡等環(huán)節(jié)，可分為致敏階段和效應(yīng)階段。

T細胞在IgE介導(dǎo)的Ⅰ型過敏反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。T細胞表面有多種特異性抗原，其中CD4代表T輔助細胞（helper T cell，Th），當與抗原相遇，Th細胞可分泌細胞因子Th1和Th2。Th1主要分泌白介素（IL）和干擾素（IFN），主要有IL-2、IFN-γ和TNF-α，負責細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。Th2與速發(fā)型超敏反應(yīng)關(guān)系密切，主要分泌IL-4、IL-5、IL-10和IL-13，能夠有效激活B細胞產(chǎn)生IgE抗體。當易感者首次接觸花粉變應(yīng)原后，花粉進入機體并釋放出一種復(fù)雜的由過敏性和非過敏蛋白質(zhì)及其他生物活性分子組成的親水混合物，誘導(dǎo)有利于Th2極化的炎癥環(huán)境激發(fā)抗體反應(yīng)，變應(yīng)原選擇性激活Th并誘發(fā)其分泌細胞因子，使Th2／Th1比例失調(diào)，誘導(dǎo)產(chǎn)生IgE抗體。IgE與嗜堿性粒細胞和肥大細胞膜表面特定高親和力受體FcεRI結(jié)合，成為致敏靶細胞，使機體處于對該變應(yīng)原的致敏狀態(tài)。當機體再次接觸相同變應(yīng)原花粉時，變應(yīng)原與靶細胞表面的IgE發(fā)生特異性結(jié)合，肥大細胞與嗜堿性粒細胞被活化并釋放組胺、前列腺素和白三烯等血管活性介質(zhì)，啟動Ⅰ型過敏反應(yīng)的效應(yīng)階段。即上述活性介質(zhì)作用于器官和效應(yīng)組織，引起局部或全身過敏反應(yīng)，表現(xiàn)出鼻塞、鼻堵、流涕、打噴嚏等急性炎癥癥狀，繼而產(chǎn)生小血管擴張、通透性增加、平滑肌收縮、支氣管收縮等變態(tài)反應(yīng)，從而引發(fā)過敏反應(yīng)。

2 花粉過敏動物模型的種類和特點

近年來國內(nèi)外用于建立過敏動物模型的方法主要是基于使變應(yīng)原進入機體，與致敏靶細胞上的IgE發(fā)生特異性結(jié)合而引發(fā)變態(tài)反應(yīng)基本原理，模型動物主要采用嚙齒類動物，也有少量應(yīng)用非嚙齒類動物模型的研究。由于花粉致敏引發(fā)各類變態(tài)反應(yīng)疾病發(fā)病機制的復(fù)雜性，因此目前還未見某一種動物模型能夠完整評價花粉的致敏性及其深入的致敏機制，單獨一種動物模型均難以達到探究花粉過敏機制的目的，往往需要依據(jù)模型特點、試驗?zāi)康暮途唧w要求有針對性地選用不同的實驗動物來構(gòu)建相應(yīng)的過敏模型。

2.1 嚙齒類動物

構(gòu)建花粉致敏動物模型常用的嚙齒類動物有小鼠、大鼠、豚鼠和新型動物（如轉(zhuǎn)基因小鼠和人源化小鼠），其中小鼠模型應(yīng)用最為普遍，各類動物的生理特點各有不同。

2.1.1 小鼠 小鼠具有免疫遺傳背景較清楚、品系較純、來源廣等優(yōu)點，各種不同品系的小鼠具有不同特性。小鼠應(yīng)用于過敏模型的建立有逐年增加的趨勢，常 用 的 品 系 有BALB／c、C57BL／6、C3H／HeJ、BDF-1和KM小鼠等，應(yīng)根據(jù)不同的研究目的選擇合適品系的小鼠建立模型。其中BALB／c小鼠屬于近交高IgE應(yīng)答品系，優(yōu)先產(chǎn)生Th2型免疫應(yīng)答和IgE抗體，尤其適用于細胞因子水平研究，也可作為篩選潛在蛋白潛在致敏性的有效模型，并且較容易獲得，應(yīng)用最為廣泛。文獻報道，應(yīng)用臭椿、樺樹、楊樹、樟樹、雪松、蒿、豚草、莧、葎草、藜、葫蘆花和軟葉針葵等花粉建立BALB／c品種小鼠致敏模型的相關(guān)研究較為豐富，也有采用其他品系小鼠建立豚草和柳樹等花粉致敏動物模型的報道。小鼠動物模型的品系種類、構(gòu)建方法及特點見表1。2.1.2 大鼠 大鼠品系純、來源廣，遺傳性狀穩(wěn)定，嗅覺靈敏，對環(huán)境中的花粉、粉塵和氣體等敏感，易誘發(fā)出過敏性鼻炎和哮喘等過敏疾病癥狀，針對吸入性變應(yīng)原易產(chǎn)生特異性IgE抗體，從而介導(dǎo)免疫應(yīng)答，對抗原的反應(yīng)性較為一致；同時，大鼠的體型比小鼠和豚鼠大，且兼有小鼠和豚鼠模型的優(yōu)點，更容易對過敏性疾病的典型特征進行有效評價；此外，大鼠的相關(guān)分子生物學(xué)試劑種類及選擇性更豐富，便于獲得。目前，常用于制備花粉過敏模型的大鼠品種有SD大鼠和BN大鼠。研究人員應(yīng)用梧桐花粉和日本雪松花粉成功建立SD大鼠和BN大鼠致敏模型。大鼠動物模型的品系種類、構(gòu)建方法及特點見表1。

表1 嚙齒類動物花粉致敏模型的品系種類、構(gòu)建方法及特點Tab.1 Species，methods and characteristics of pollen allergic rodent model

續(xù)表1

2.1.3 豚鼠 豚鼠具有易感性，對多種變應(yīng)原具有良好的敏感性，是速發(fā)型過敏性呼吸道疾病和過敏性休克的良好動物模型，也是在花粉致敏性預(yù)測與

評價中應(yīng)用的過敏動物模型之一。研究人員應(yīng)用豚草、艾蒿、楊樹和日本雪松花粉成功建立了豚鼠致敏模型，見表1。但是相比于小鼠等實驗動物，豚鼠的敏感性過強，個體反應(yīng)差異大，在利用花粉變應(yīng)原造模過程中容易出現(xiàn)明顯反應(yīng)甚至死亡；此外用于豚鼠的檢測試劑較少，豚鼠Ⅰ型過敏反應(yīng)預(yù)測模型主要靠主觀評價進行結(jié)果判斷，只能定性，不容易定量，容易產(chǎn)生誤差；另外豚鼠操作難度較大，特別是注射難度較大，影響因素較多，對結(jié)果的客觀性容易產(chǎn)生影響。目前采用豚鼠作為過敏模型的研究已呈減少的趨勢。

對表1的內(nèi)容從花粉變應(yīng)原種類、模型構(gòu)建方法、優(yōu)點和不足等特點進行分析，結(jié)果提示：遺傳背景在誘導(dǎo)花粉過敏模型中起著重要的影響，不同品系的嚙齒類動物對花粉變應(yīng)原多樣性存在不同的反應(yīng)，這與為何只有部分人群對花粉引發(fā)過敏反應(yīng)的情況相似；不同的致敏／激發(fā)途徑等致敏方式差異在致敏動物模型構(gòu)建方法中也產(chǎn)生重要影響。研究結(jié)果提示相同品系嚙齒類動物給予相同的花粉變應(yīng)原但致敏方式不同，也可能得到不同的模型。

基于上述分析，花粉致敏的嚙齒類動物，尤其小鼠模型方法的選擇可以依據(jù)研究者的目的及條件來合理化地設(shè)計實驗。一般為了進一步驗證或說明實驗結(jié)果的可靠性，研究者會采用不同動物模型、動物模型和細胞模型結(jié)合或是動物或細胞模型與體外其他實驗方法結(jié)合來完成一個試驗?zāi)康?。例如，朱敬敬等采用BALB／c小鼠和豚鼠2種不同動物模型評價豚草花粉誘導(dǎo)過敏性結(jié)膜炎及藥物干預(yù)作用，說明了不同遺傳背景的嚙齒類動物模型對研究結(jié)果的影響。這些研究結(jié)果及其他相關(guān)研究結(jié)果說明，盡管人類和嚙齒類動物（如小鼠）的免疫系統(tǒng)非常相似，但是對于不同物種之間的先天性免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)的差異是必須要考慮的，選擇不同實驗動物及品系、依據(jù)其特點建立適合評價花粉過敏反應(yīng)的動物模型是Ⅰ型過敏反應(yīng)機制基礎(chǔ)研究中關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。

2.2 非嚙齒類動物

迄今建立的花粉誘導(dǎo)的非嚙齒類過敏反應(yīng)模型主要有艾蒿花粉誘導(dǎo)的兔過敏反應(yīng)模型。其他種類的非嚙齒類動物有應(yīng)用于食物過敏、藥物過敏等的研究報道，但是針對花粉過敏的研究極為有限。原因主要是非嚙齒類動物的品種差異比嚙齒類動物大，各類動物的免疫應(yīng)答不僅以IgE介導(dǎo)為主，對花粉變應(yīng)原反應(yīng)的一致性難于評價，同時也缺乏品種齊全的各類商業(yè)性相關(guān)免疫試劑，此外非嚙齒類動物實驗更容易引發(fā)倫理及道德爭議，故很難將非嚙齒類動物應(yīng)用于花粉致敏性評價及潛在安全性評估中的常規(guī)測試。

2.3 新型動物

隨著過敏動物模型、基因工程小鼠和人源化小鼠等新型動物模型研究的深入，近年來國外學(xué)者逐漸關(guān)注應(yīng)用基因工程小鼠和人源化小鼠等新型動物構(gòu)建過敏動物模型，其在花粉致敏性評價及過敏機制研究中表現(xiàn)出了一定的優(yōu)勢。

2.3.1 基因工程動物新型模型 基因工程動物的

構(gòu)建主要是通過插入、敲除或修飾靶基因等基因工程技術(shù)方法，改變動物原有基因或者對其基因組加以修飾，從而得到具有特定表型或者表現(xiàn)某些病理特征的動物，是現(xiàn)代基因功能和人類疾病研究中的一類重要動物模型。其中以基因工程小鼠應(yīng)用最為普遍。普遍采用的基因工程技術(shù)主要包括基因敲除或敲入、轉(zhuǎn)基因或定點轉(zhuǎn)基因、基因過表達及人源化等方法。已有研究報道將基因工程小鼠和人源化小鼠模型應(yīng)用于構(gòu)建花粉致敏動物模型，這類新型動物模型在一定程度能更有針對性和目的性地表達致敏特征，但是其免疫細胞和相應(yīng)因子與人類及常規(guī)動物相比還存在缺乏系統(tǒng)性改變等問題，仍很難模仿人類花粉癥過敏性疾病的主要病理過程。同時該類新型模型的致敏可重復(fù)性及構(gòu)建標準也有待進一步探索。

2.3.2 新型動物繁育策略 目前基因工程動物的構(gòu)建和繁育多采用129 S和C57BL／6遺傳背景小鼠，在應(yīng)用上既要滿足實驗?zāi)康牡男枨螅瑫r也要達到繁殖建系的功能要求，因此對一個基因工程動物品系的構(gòu)建和繁育兼有遺傳特性和生存質(zhì)量兩個方面的明確要求，同時也對其具體的繁育策略與技術(shù)提出了相應(yīng)的要求。通?；蚬こ绦∈蠡颈Ａ羝湓衅废当尘暗纳砹?xí)性，構(gòu)建過程的第一代能得到的陽性動物數(shù)量普遍很少（多為3～5只），很難滿足實驗要求，這就需要通過適宜的繁育策略與技術(shù)來增加該特定基因型小鼠的數(shù)量，一般是通過將構(gòu)建的基因型小鼠與野生型小鼠交配，再對其進行鑒定，選擇其中攜帶基因突變或特定基因的后代。繁育種鼠的選擇：基因工程小鼠繁育生產(chǎn)的目標是快速地繁育且能生產(chǎn)出足夠數(shù)量的子代小鼠以供篩選，選擇繁育種鼠是首要環(huán)節(jié)，在配繁前，首先需要確認繁育種鼠的遺傳背景和基因型，除特殊實驗需求之外，一般使用同背景小鼠進行配繁?；蛐∈蟮姆N類：近年來國外應(yīng)用于致敏動物模型研究的基因工程小鼠種類主要有轉(zhuǎn)基因小鼠、KO／KI（knockout／knockin）小鼠、CKO（conditional knockout）小鼠和人源化小鼠。在明確相應(yīng)的靶基因基礎(chǔ)上，采用的繁育技術(shù)主要有基于DNA原核顯微注射的轉(zhuǎn)基因繁育、基于ES打靶技術(shù)構(gòu)建的KO／KI和CKO繁育、基于CRISPR／Cas 9技術(shù)構(gòu)建的KO／KI和CKO繁育等。經(jīng)常出現(xiàn)的繁育問題主要包括小鼠打架、小鼠脫毛、雌鼠食仔、品系污染、無法得到純合子等。

3 花粉過敏動物模型的檢測與評價指標

花粉過敏動物模型的評價一般根據(jù)動物的整體反應(yīng)特點和相關(guān)指標檢測來確定，一般包括癥狀觀察、特異性抗體檢測、組織病理形態(tài)和輔助檢測分析。

3.1 癥狀觀察與評分

花粉過敏動物的過敏反應(yīng)并不局限在局部，變應(yīng)性鼻炎、過敏性哮喘及過敏性結(jié)膜炎等可視為全身過敏反應(yīng)的局部表現(xiàn)。癥狀觀察是在對花粉致敏模型動物經(jīng)抗原激發(fā)后進行體征和典型癥狀觀察，時間約30 min，主要通過觀察致敏動物的呼吸系統(tǒng)及其他典型癥狀表現(xiàn)進行評分，總體評價動物過敏反應(yīng)的程度。如呼吸系統(tǒng)過敏反應(yīng)癥狀可觀察到小鼠有撓鼻、流涕、打噴嚏等過敏性鼻炎癥狀，咳嗽、喘息等過敏性哮喘癥狀，局部可觀察到結(jié)膜水腫、結(jié)膜充血、眼瞼腫脹、流淚等過敏性結(jié)膜炎癥狀，陰性表現(xiàn)為無癥狀，可依據(jù)各種癥狀出現(xiàn)的頻次和程度進行評分。通過癥狀觀察與評分可初步判斷花粉過敏的程度，但判斷可能有一定的主觀性和局限性。為增加結(jié)果的準確性，一般結(jié)合具體、可重復(fù)和可定量的實驗檢測指標進行評價與驗證。

3.2 抗體檢測及特異性IgE水平測定

花粉導(dǎo)機體產(chǎn)生Ⅰ型過敏反應(yīng)時，IgE與肥大細胞結(jié)合導(dǎo)致肥大細胞脫顆粒，釋放多種活性物質(zhì)，客觀定量檢測血清中花粉特異性IgE水平是其病理生理機制研究的主要評價指標。一般多應(yīng)用實驗動物血清和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）檢測血清中花粉特異性IgE水平。

3.3 組織病理形態(tài)學(xué)檢測

花粉過敏誘發(fā)實驗動物發(fā)生IgE依賴的過敏反應(yīng)的局部組織病理變化可通過對動物的鼻黏膜、肺、結(jié)膜等組織取材進行檢測。一般對組織切片染色后在400倍光學(xué)顯微鏡下觀測，檢測組織間質(zhì)有無明顯的以淋巴細胞、嗜酸性粒細胞或中性粒細胞為主的細胞浸潤炎癥病變、出現(xiàn)水腫滲出及組織間隔增厚等炎癥性表現(xiàn)?？刹捎秒S機觀察或電腦視頻計數(shù)，對視野中隨機200個細胞中嗜酸性粒細胞數(shù)、肥大細胞總數(shù)和肥大細胞脫顆粒數(shù)進行統(tǒng)計，計算肥大細胞脫顆粒百分比。上述檢測指標能客觀和定量地反映花粉過敏反應(yīng)的組織炎癥性病變和血管通透性增高病理特征。

3.4 其他輔助檢測指標

除上述評價指標外，還可以進行免疫細胞相關(guān)表型、相關(guān)細胞因子種類及濃度水平、外周血抗體和補體水平檢測、氣道高反應(yīng)性及過繼傳輸激發(fā)實驗等輔助評價，主要檢測指標有IL-10和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等。細胞因子IL-10和VEGF與Ⅰ型過敏反應(yīng)特異性抗體IgE密切關(guān)聯(lián)，均由與速發(fā)型超敏反應(yīng)關(guān)系密切的Th2細胞所分泌，能有效激活B細胞產(chǎn)生IgE，從而引發(fā)效應(yīng)組織和器官Ⅰ型過敏反應(yīng)。

4 小結(jié)與展望

花粉致敏存在著特異性和不可預(yù)測性，不同種類花粉變應(yīng)原所引發(fā)的過敏性疾病表現(xiàn)及其發(fā)病機制存在著一定差異，花粉變應(yīng)原及致敏蛋白種類、花粉吸入途徑、遺傳特點、免疫狀態(tài)等因素均與花粉過敏的發(fā)生有關(guān)，同時由于個體差異的復(fù)雜性和多樣性，不同個體接觸花粉變應(yīng)原后存在機體的敏感性差異，從而表現(xiàn)出各種不同的臨床癥狀，因此花粉過敏性疾病的種類、病理癥狀及其表現(xiàn)程度均不盡相同。

盡管近年來花粉致敏動物模型研究已取得了較為豐富的結(jié)果，在一定程度上能夠較好地揭示相關(guān)細胞因子表達、信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)等信息，但是，品種有限的花粉過敏動物模型（主要集中在嚙齒類動物模型）和單一的模型構(gòu)建方式（一般多采用抗原系統(tǒng)性致敏，再隨后進行局部激發(fā)）仍是目前存在的主要限制因素，在一定程度上制約著對花粉過敏的流行病學(xué)、變應(yīng)原分析、致敏機制和病理發(fā)展等方面的深入研究。因此，適宜的花粉過敏動物模型選擇和構(gòu)建是花粉致敏性評價、病理機制和脫敏治療等研究的重要手段。特征穩(wěn)定和確切有效的花粉過敏動物模型，可為研究各種花粉變應(yīng)原的致敏性、揭示花粉過敏疾病的致敏機制及病理過程、評估花粉過敏風險等提供基礎(chǔ)，也可為預(yù)測各類花粉及其變應(yīng)原的潛在致敏性提供方法和思路。

目前國內(nèi)外已有的各類花粉致敏模型各自存在一定的局限性，對各類花粉致敏的動物模型構(gòu)建和評價方法還有必要進一步加強重復(fù)性驗證和標準化研究，以使其在花粉致敏性評價及其致敏機制研究中發(fā)揮更重要的作用?；蚪M學(xué)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等現(xiàn)代生物技術(shù)的研究日益深入，一些與變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的靶基因及其表達調(diào)控機制也相應(yīng)被揭示，為建立有針對性的、穩(wěn)定高效的花粉過敏新型動物提供了前景，可通過構(gòu)建特定靶基因調(diào)控的花粉過敏新型動物模型，為花粉過敏疾病及其機制研究提供準確的證據(jù)。隨著信息技術(shù)和數(shù)據(jù)分析平臺的發(fā)展，通過結(jié)合變應(yīng)原結(jié)構(gòu)信息數(shù)據(jù)分析，花粉過敏動物模型的選擇與構(gòu)建研究也可為花粉變應(yīng)原預(yù)測及其致敏風險評估提供參考，為花粉過敏性疾病的綜合防控提供有效的方法和手段。