王玉嬌，李彥芹，張汝美，蔡高占，趙秀新，顧祥國(guó)，李俊婷，姚文龍，李建斌*，仲躋峰*

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，濟(jì)南 250100；2.山東奧克斯畜牧種業(yè)有限公司，濟(jì)南 250108；3.寧波市牛奶集團(tuán)有限公司，浙江 寧波 315033；4.寧波市鄞州瞻岐鷹山牛場(chǎng)，浙江 寧波 315145）

自由馬丁（freemartinism）綜合征是異性雙胎牛性器官發(fā)育紊亂疾病，主要表現(xiàn)為母牛生殖器官發(fā)育不全、雄性化或不育等特征，其主要機(jī)制是雙胎胚胎早期的尿膜絨毛膜血管之間有吻合支，雄性胎兒分泌的雄性激素會(huì)通過(guò)吻合支進(jìn)入雌性胎兒體內(nèi)，抑制雌性生殖器官的發(fā)育。異性雙胎對(duì)公牛生殖能力的影響尚不確定，然而確有造成生殖能力下降的報(bào)道。牛雙胎時(shí)多達(dá)97%胎兒會(huì)發(fā)生尿膜絨毛膜血管吻合。荷斯坦牛雙胎率大約為5%，個(gè)別牛群可達(dá)10%甚至更高。而且牛的雙胎率可能會(huì)越來(lái)越高，自然會(huì)造成自由馬丁發(fā)生率的增加。

自由馬丁初步診斷一般是基于小母牛生殖道的臨床檢查，以及是否來(lái)自雙胎或多胎等信息。而確診需要進(jìn)行遺傳學(xué)檢查，即確定細(xì)胞中是否存在XX／XY嵌合體。細(xì)胞遺傳學(xué)和分子技術(shù)可以應(yīng)用于自由馬丁診斷，一般染色體分析是最常見(jiàn)的方法。細(xì)胞遺傳學(xué)鑒定常用的方法包括吉姆薩染色法、染色體分帶或性染色體探針熒光原位雜交法等。分子技術(shù)主要包括PCR、qPCR或性染色體連鎖微衛(wèi)星標(biāo)記分型法等。細(xì)胞遺傳學(xué)分析可以精準(zhǔn)確定XX和XY細(xì)胞比例，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且整個(gè)程序涉及無(wú)菌采集血液樣本、迅速（約24 h內(nèi)）運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室、白細(xì)胞培養(yǎng)（48 h或72 h內(nèi)）、專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行分析等。Y連鎖基因的PCR方法比較容易，但不能檢測(cè)細(xì)胞中XX比例較小的XX／XY嵌合體；而且需要增加輔助研究，如其他組織（毛囊、唾液）中微衛(wèi)星標(biāo)記的分析等。

微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）是第三代PCR，為檢測(cè)XX／XY嵌合體提供了新的可能性。該方法利用有限稀釋和泊松分布可以實(shí)現(xiàn)樣品中目標(biāo)核酸的精確定量。ddPCR是一種終點(diǎn)測(cè)量方法，可克服傳統(tǒng)PCR不能檢測(cè)低豐度核酸的局限性，并且不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核心的直接精確絕對(duì)定量，法醫(yī)上已經(jīng)應(yīng)用于對(duì)混合遺傳特征和人類(lèi)臨床嵌合現(xiàn)象的研究，在動(dòng)物上已用于檢測(cè)豬白細(xì)胞嵌合體。建立快速準(zhǔn)確的自由馬丁綜合征診斷方法對(duì)牛的繁育生產(chǎn)有著非常重要的意義。試驗(yàn)對(duì)中國(guó)荷斯坦母牛的異性孿生母犢進(jìn)行ddPCR檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集

13～15月齡中國(guó)荷斯坦母牛7頭，來(lái)源于山東省某牛場(chǎng)。母牛個(gè)體發(fā)育與同群其他個(gè)體沒(méi)有明顯差異，因?yàn)榕浞N5次以上未孕，進(jìn)行了直腸檢查，發(fā)現(xiàn)存在子宮小、單子宮角等子宮發(fā)育不全特征。經(jīng)與技術(shù)人員溝通，這些母牛可能是異性雙胎中的母犢。為鑒定是否為自由馬丁綜合征，每頭牛尾靜脈采集外周血10 mL于抗凝管中，-20℃保存，備用。

1.2 主要試劑和儀器設(shè)備

血液基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；ddPCRSupermix for Probes、微滴生成油，Bio-Rad公司產(chǎn)品。

離心機(jī)（型號(hào)為iCEN-24R），杭州奧盛儀器有限公司；分光光度計(jì)（型號(hào)為NanoDrop 8000 Micro），賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司產(chǎn)品；QX200數(shù)字PCR儀、PX1熱封儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品。以上試劑和儀器均來(lái)源于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室。

1.3 DNA的提取

使用血液基因組DNA提取試劑盒嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟提取DNA，用分光光度計(jì)測(cè)定提取后的DNA濃度，保證DNA濃度在10 ng／μL以上。

1.4 引物和探針設(shè)計(jì)

哺乳動(dòng)物中AMEL基因定位于性染色體上，該基因在不同性染色體中存在獨(dú)立進(jìn)化的特征，AMEL基因在X染色體（AMEL-X）和Y染色體（AMELY）以不完全一致的形式存在，AMEL基因這一特性非常適合作為X和Y染色體區(qū)分的靶標(biāo)基因。通過(guò)ddPCR技術(shù)鑒定AMEL-X和AMEL-Y基因拷貝數(shù)估算X和Y染色體的拷貝數(shù)。參考相關(guān)文獻(xiàn)及NCBI的引物序列，設(shè)計(jì)ddPCR的靶標(biāo)基因引物和探針。序列如下：AMEL-X正向引物，5′-CATGCAGCCCTTGCA-3′；AMEL-X 反 向 引 物，5′-ATATCGGAGGCAGAGGT-3′；AMEL-Y正向引物，5′-ACCAACCCCTGCAG-3′；AMEL-Y反向引物，5′-TGCATGGGGAATATTGGAG-3′；AMEL-X 探針 （HEX），HEX -CAGCCCTTGCCGC-BHQ1；AMEL-Y探針（FAM），F(xiàn)AM-CAGCGCTTGCCACCBHQ1。

1.5 ddPCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

1）將ddPCRSupermix for Probes（No dUTP）在室溫下融解，上下顛倒混勻，12 000 r／min離心2 min。

2）配制ddPCR Reaction Mix，反應(yīng)體系見(jiàn)表1。

表1 dd PCR反應(yīng)體系Tab.1 dd PCR reaction system

3）配好的反應(yīng)體系振蕩混勻，12 000 r／min離心2 min后，小心地轉(zhuǎn)移到微滴發(fā)生卡中間一排的樣品孔內(nèi)，并在下排孔中加入70μL微滴發(fā)生油，然后在微滴生成儀中生成微滴。

4）將生成好微滴的樣品40μL從微滴發(fā)生卡的上排孔中轉(zhuǎn)移到ddPCR專(zhuān)用孔板中，蓋上鋁膜后用PX1熱封儀對(duì)孔板進(jìn)行封膜。

5）PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表2。

表2 PCR反應(yīng)條件Tab.2 PCR reaction conditions

6）PCR結(jié)束后，將孔板取出，在微滴讀取儀上進(jìn)行微滴讀取。

7）微滴讀取結(jié)束后，在Bio-Rad QuantaSoft軟件上分析數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.6 測(cè)定項(xiàng)目

測(cè)定AMEL-X的一維液滴分布、AMEL-Y的一維液滴分布及AMEL-X和AMEL-Y基因拷貝數(shù)，并計(jì)算AMEL-Y／AMEL-X。

2 結(jié)果與分析

本試驗(yàn)為單通道試驗(yàn)，在只加入AMEL-X探針樣本測(cè)定時(shí)使用通道2（見(jiàn)圖1），只加入AMEL-Y探針樣本時(shí)使用通道1（見(jiàn)圖2）。圖1中綠色的是陽(yáng)性液滴，含有可擴(kuò)增模板（AMEL-X片段）的液滴；灰色的是陰性液滴，不含有可擴(kuò)增模板的液滴。陽(yáng)性液滴為6 876，陰性液滴為107 249，其中A05、C05、D05、E05、F05、B06、C06為只加入AMEL-X探針的樣本1～7。圖2中藍(lán)色的是陽(yáng)性液滴，含有可擴(kuò)增模板（AMEL-Y片段）的液滴；灰色的為陰性液滴，不含有可擴(kuò)增模板的液滴。陽(yáng)性液滴為3 253，陰性液滴為106 866，其中A07、C07、D07、E07、F07、F06、G06為只加入AMEL-Y探針的樣本1～7。圖1和圖2中的陰性液滴和陽(yáng)性液滴明顯分成兩簇，表明試驗(yàn)結(jié)果良好。根據(jù)陰性液滴和陽(yáng)性液滴的比例可以得出ddPCR反應(yīng)中可擴(kuò)增模板的拷貝數(shù)，見(jiàn)圖3。測(cè)得樣本1～7的AMEL-X和AMEL-Y的基因拷貝 數(shù) 分 別 為147 copies／μL 和62 copies／μL，99 copies／μL和22.3 copies／μL，60.4 copies／μL和17.8 copies／μL，27.3 copies／μL和24.6 copies／μL，97 copies／μL和71.9 copies／μL，65.2 copies／μL和34.8 copies／μL，36.6 copies／μL和17.9 copies／μL。根據(jù)ddPCR測(cè)定的濃度推算出原樣本的基因濃度見(jiàn)表3。計(jì)算得出這7個(gè)原樣本中AMEL-X拷貝數(shù)濃度范圍為273 ～1 470 copies／μL，AMEL-Y拷貝數(shù)濃度范圍為178 ～719 copies／μL；以此計(jì)算，得出AMEL-Y基因濃度與AMEL-X基因濃度的比例范圍為0.23～0.90。這說(shuō)明試驗(yàn)檢測(cè)的7頭母牛血液樣本中均含有Y染色體，為XX／XY嵌合體，可以判定為異性孿生母犢不孕的個(gè)體。該結(jié)果與母牛直腸檢查結(jié)果一致。

表3 ddPCR定量結(jié)果Tab.3 ddPCR quantitative results

圖1 AMEL-X的一維液滴分布圖Fig.1 One-dimensional droplet distribution map of AMEL-X

圖2 AMEL-Y的一維液滴分布圖Fig.2 One-dimensional droplet distribution map of AMEL-Y

圖3 AMEL-X和AMEL-Y基因拷貝數(shù)Fig.3 AMEL-X and AMEL-Y gene copy numbers

3 討論

一般情況下，異性孿生母牛在性成熟前與正常個(gè)體發(fā)育相似，但在性成熟后表現(xiàn)與正常母牛不同，體型和公牛相似，頭和角都變得粗大，哞叫聲也像公牛，性情粗暴，乳房極不發(fā)達(dá)，子宮和卵巢發(fā)育不全，但如果不仔細(xì)觀察很難發(fā)現(xiàn)。尤其在大型規(guī)?；翀?chǎng)更難發(fā)現(xiàn)，只有到配種時(shí)發(fā)現(xiàn)屢配不孕，進(jìn)一步檢查時(shí)方能檢查。

先前有研究者對(duì)異性孿生母犢不孕個(gè)體中的染色體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)異性孿生母犢的染色體有XX、XXY、XY等組型，正常母犢個(gè)體的染色體應(yīng)該為XX組型，因此在孿生母牛樣本中檢測(cè)到Y(jié)染色體就可以判定為異性孿生不孕個(gè)體。也有研究表明，XX／XY嵌合體的公牛睪丸發(fā)育不全。

基于時(shí)間和成本及檢測(cè)準(zhǔn)確度、靈敏度方面的考慮，ddPCR技術(shù)是一個(gè)有效的檢測(cè)XX／XY嵌合體的方法。ddPCR檢測(cè)嵌合體的方法曾應(yīng)用于豬等動(dòng)物。ddPCR是第三代PCR技術(shù)，是一種終點(diǎn)測(cè)量方法，無(wú)需使用標(biāo)準(zhǔn)曲線即可進(jìn)行定量，通過(guò)與X和Y染色體相關(guān)聯(lián)的基因可以對(duì)染色體拷貝數(shù)進(jìn)行定量。在哺乳動(dòng)物中高度保守的AMEL基因恰好滿足這個(gè)要求，AMEL基因在X和Y染色體上均表達(dá)但并不完全一致，AMEL基因已用于綿羊、水牛等多種哺乳動(dòng)物的性別鑒定。

I.Szczerbal等為了評(píng)判ddPCR在檢測(cè)牛XX／XY染色體嵌合方面的特異性，按比例稀釋雌性（XX）DNA與雄性（XY）DNA混合樣本，利用ddPCR進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，ddPCR可以檢測(cè)到XX（98%）／XY（2%）到XX（4%）／XY（96%）比例的混合樣本。證明ddPCR技術(shù)在檢測(cè)牛XX／XY染色體嵌合方面可以達(dá)到較高的準(zhǔn)確性，并且檢測(cè)結(jié)果與細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果相符。本試驗(yàn)中，基因濃度的比例范圍為0.23～0.90。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)中，選擇ddPCR方法對(duì)7頭中國(guó)荷斯坦異性孿生雙胎的母牛外周血進(jìn)行鑒定，并根據(jù)異性孿生母犢不孕的個(gè)體染色體為XX／XY嵌合、正常母牛染色體為XX來(lái)判定是否為嵌合體。結(jié)果表明，此7個(gè)樣本均存在XX／XY染色體嵌合，均為異性孿生不孕母犢。