李令星 吳寅 李富堅(jiān)

摘 要：本文對(duì)水相法合成磷脂酰絲氨酸在工業(yè)生產(chǎn)中的關(guān)鍵變量進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，水相法合成磷脂酰絲氨酸最佳體系為水量∶大豆磷脂∶絲氨酸的比例為3.0∶1.0∶0.8（mL∶g∶g）、酶液添加量為磷脂酰膽堿的20%、溫度45 ℃、時(shí)間6 h。最終磷脂酰絲氨酸含量為54.52%，轉(zhuǎn)化率高達(dá)93.4%。本研究為磷脂酰絲氨酸在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了重要參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：磷脂酰絲氨酸;大豆磷脂;體系優(yōu)化

Optimization of the System for the Synthesis of Phosphatidylserine by Aqueous Method

LI Lingxing， WU Yin， LI Fujian

（Wengyuan Guangye Swiss Food Science&Technology Co.， Ltd.， Shaoguan 512000， China）

Abstract： In this paper， the key variables of phosphatidylserine synthesis by water phase method in industrial production were studied. The results showed that the optimum conditions for the synthesis of phosphatidylserine by water phase method were as follows： the ratio of water to soy phosphatidylserine was 3∶1∶0.8（mL∶g∶g）， the dosage of enzyme was 20% of phosphatidylcholine， the temperature was 45 ℃， and the time was 6 h. The final?phosphatidylserine content was 54.52% and the conversion rate was 93.4%. This study provides an important reference for the application of phosphatidylserine in industrial production.

Keywords： phosphatidylserine; soybean phospholipid; system optimization

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）具有提高大腦認(rèn)知[1]、修復(fù)大腦損傷[2-3]等功能，在食品、保健品、醫(yī)藥等多個(gè)行業(yè)被廣泛應(yīng)用[4-5]。隨著對(duì)PS功效應(yīng)用的研究的不斷深入，其市場(chǎng)需求也日益增長(zhǎng)。在PS眾多生產(chǎn)方法中，酶法反應(yīng)因條件溫和、易控、高效簡(jiǎn)單而成為生產(chǎn)主流。酶法反應(yīng)將絲氨酸溶于水，磷脂酰膽堿（1，2-diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine，PC）溶于有機(jī)溶劑，兩相反應(yīng)。隨著人們對(duì)食品安全的愈發(fā)重視，溶劑殘留也愈發(fā)受到關(guān)注。本文研究了磷脂酰膽堿在純水相中合成磷脂酰絲氨酸的關(guān)鍵變量，為磷脂酰絲氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)中提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

正己烷，異丙醇均為色譜純;乙酸、三乙胺、三氯甲烷均為分析純;大豆磷脂（哈爾濱九三，PC含量≥55.0%）;絲氨酸（浙江普洛）;磷脂酶D，公司自產(chǎn)發(fā)酵制備;PS標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma）;PC標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma）。

Agilent 1260液相色譜儀配ELSD檢測(cè)器（安捷倫）;分析天平BSA224S（賽多利斯）;高速離心機(jī)（湖北湘儀）;RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱Lichrospher 100 diol（100 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相A（正己烷∶異丙醇∶乙酸∶三乙胺=820∶170∶10∶0.8）;流動(dòng)相B（異丙醇∶水∶乙酸∶三乙胺=850∶140∶10∶0.8），A、B兩相梯度洗脫：0～8.5 min，5%→36% B;8.5～12 min，36%→38% B;12～15 min，38%→100% B;15～15.5 min，100%→5% B;15.5～20 min，95% B;流速：1.0 mL/min;進(jìn)樣量：20 μL;檢測(cè)器漂移管溫度：85 ℃;氣體流速：2.5 L/min;柱溫：35 ℃[6]。

1.2.2 分析方法

分別精確稱(chēng)取PS、PC標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用三氯甲烷定容至25 mL，混合均勻，制成標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。用移液管準(zhǔn)確吸取1 mL、3 mL、5 mL、7 mL和9 mL儲(chǔ)備液，用三氯甲烷定容至10 mL，制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。稱(chēng)取10 mg樣品，用三氯甲烷定容至25 mL，搖勻，制成樣品溶液，并用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分析樣品的PS和PC含量。在選定色譜條件下，以PS、PC峰面積（W）為縱坐標(biāo)，PS、PC濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到回歸方程為W（PS）=74.55C+24.68，R=0.999 62;W（PC）=52.61C+72.36，R=0.999 29，表明PS和PC在選定濃度下具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取100 g PC和100 g絲氨酸，加入500 mL水和25 mL酶液，37 ℃反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束后離心分離絲氨酸，沉淀負(fù)壓干燥后獲得PS產(chǎn)品，測(cè)定產(chǎn)品PS和PC含量。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定純水相法反應(yīng)PS的最適條件。

（1）物料比對(duì)PC合成PS的影響。按表1稱(chēng)取物料，加入25 mL酶液，37 ℃反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束，離心、分離絲氨酸，沉淀負(fù)壓干燥后獲得PS產(chǎn)品，測(cè)定產(chǎn)品中PS和PC含量，確定最適物料比。

（2）酶液添加量對(duì)PC合成PS的影響。稱(chēng)取100 g?PC和80 g絲氨酸，加入300 mL水，按PC添加量的5%、10%、15%、20%和25%，分別加入5 mL、10 mL、15 mL、20 mL和25 mL酶液，37 ℃反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束離心、分離絲氨酸，沉淀負(fù)壓干燥后獲得PS產(chǎn)品，測(cè)定產(chǎn)品中PS和PC含量，確定最適酶液添加量。

（3）反應(yīng)時(shí)間對(duì)PC合成PS的影響。稱(chēng)取100 g PC和80 g絲氨酸，加入300 mL水和20 mL酶液，37 ℃分別反應(yīng)2 h、4 h、6 h、8 h和10 h，反應(yīng)結(jié)束，離心分離絲氨酸，沉淀負(fù)壓干燥后獲得PS產(chǎn)品，測(cè)定產(chǎn)品中PS和PC含量，確定最適反應(yīng)時(shí)間。

（4）反應(yīng)溫度對(duì)PC合成PS的影響。稱(chēng)取100 g PC和80 g絲氨酸，加入300 mL水和20 mL酶液，分別在28 ℃、37 ℃、42 ℃、45 ℃和50 ℃反應(yīng)6 h，反應(yīng)結(jié)束，離心分離絲氨酸，沉淀負(fù)壓干燥后獲得PS產(chǎn)品，測(cè)定產(chǎn)品中PS和PC含量，確定最適反應(yīng)溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)品圖譜

經(jīng)HPLC檢測(cè)及圖譜分析（圖1），產(chǎn)品中PS含量為54.52%（保留時(shí)間9.891 min），反應(yīng)前原料中PC含量為58.35%，反應(yīng)結(jié)束后，PC含量為4.33%（保留時(shí)間8.384 min），PC轉(zhuǎn)化率為93.40%。

2.2 物料比對(duì)PC合成PS的影響

由表2可知，當(dāng)水∶PC=1∶1（mL∶g）時(shí)，水量不足，物料混合不充分，PS生成率不高;水∶PC=3∶1（mL∶g）時(shí)，水量剛好合適，物料混合充分，反應(yīng)效能達(dá)到最高;水∶PC=5∶1（mL∶g）時(shí)，水量過(guò)多，PC有更多活動(dòng)空間，PC逐漸凝聚成團(tuán)，減少了與絲氨酸接觸的機(jī)會(huì)，導(dǎo)致PS合成反而降低，因而水∶PC=3∶1（mL∶g）為宜。當(dāng)絲氨酸∶PC=0.5∶1（g∶g）時(shí)，絲氨酸添加量較少，無(wú)法與PC充分接觸，反應(yīng)不充分;絲氨酸∶PC=0.8∶1（g∶g）時(shí)，絲氨酸添加量正好合適，與PC充分接觸，反應(yīng)效能達(dá)到最高;絲氨酸∶PC=1∶1（g∶g）時(shí)，絲氨酸已過(guò)量，但PS合成也不會(huì)繼續(xù)加大，且前期絲氨酸用量加大，后期則需要更多純水洗去多余的絲氨酸，因而絲氨酸∶PC=0.8∶1（g∶g）最適宜。綜合考慮。水、PC和絲氨酸的比例為3∶1∶0.8（mL∶g∶g）時(shí)最合適。

2.3 酶液添加量對(duì)PC合成PS的影響

由表3可知，隨著酶用量逐漸增大，PS合成率逐漸增加，當(dāng)酶液添加量為PC的20%時(shí)，PS合成效能最大，當(dāng)酶添加量超過(guò)PC的20%后，PS合成反而降低。在酶添加量較少時(shí)，活性因子不能充分接觸底物，因而PS合成率不高，當(dāng)酶添加量超出最適添加量后，磷脂酶將本已合成的PS分解成為磷脂酸（PA），導(dǎo)致PS合成率降低。綜合考慮，最適酶液添加量為PC的20%。

2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)PC合成PS的影響

由表4可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，PS合成率逐漸加大，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為6 h時(shí)，PS合成效能最大，繼續(xù)反應(yīng)，磷脂酶開(kāi)始反作用于PS，使PS分解，導(dǎo)致PS合成率降低。綜合考慮，反應(yīng)時(shí)間為6 h最適宜。

2.5 反應(yīng)溫度對(duì)PC合成PS的影響

由表5可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，PS合成率逐漸增大。當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到45 ℃時(shí)，PS合成效能最大，繼續(xù)提高反應(yīng)溫度，磷脂酶逐漸失活，失去作用。當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，磷脂酶完全失去活性，無(wú)法催化PC合成PS，因而選定反應(yīng)溫度為45 ℃。

3 結(jié)論

本文通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了水相法合成磷脂酰絲氨酸在工業(yè)生產(chǎn)中的關(guān)鍵變量，結(jié)果表明，最適用水量∶大豆磷脂∶L-絲氨酸的比例為3∶1∶0.8（mL∶g∶g）、酶液添加量為PC的20%、反應(yīng)溫度45 ℃、反應(yīng)時(shí)間6 h。在最適反應(yīng)條件下獲得PS含量為54.52%，符合新資源食品質(zhì)量要求，PC轉(zhuǎn)化率為93.40%。為無(wú)溶劑合成PS在工業(yè)化生產(chǎn)中提供重要依據(jù)。

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