李君君，劉林秋，文家維，陳涵婷，何 洋

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137; 2.四川省腫瘤醫(yī)院·研究所四川省癌癥防治中心臨床藥學(xué)部，四川 成都 610041)

0 引 言

黃連Coptis chinensisFranch.為毛茛科黃連屬，多年生草本植物，傳統(tǒng)中藥材，應(yīng)用歷史悠久，其主要藥用部位為根莖[1]。現(xiàn)代研究表明，生物堿類(lèi)化合物為其主要有效成分，包括小檗堿、黃連堿、巴馬汀堿、藥根堿、非洲防已堿以及表小檗堿，其中小檗堿含量最高[2]。生物堿類(lèi)化合物大多具有優(yōu)越的藥理活性，現(xiàn)已證實(shí)具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和抗菌等藥理作用[3-4]，具有較高的醫(yī)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。黃連在我國(guó)分布范圍較廣，四川、重慶、湖南、湖北以及陜西等地都有分布，但不同產(chǎn)地黃連的藥用成分含量存在差異，其臨床療效也存在差異[5]。中藥品質(zhì)是種質(zhì)遺傳、生態(tài)環(huán)境及藥材表型三者協(xié)調(diào)進(jìn)化的結(jié)果，環(huán)境的變化也必然會(huì)導(dǎo)致遺傳與表型的改變，由此造成藥用成分含量及藥用品質(zhì)的改變，這也是藥材品質(zhì)差異區(qū)別所在[6]。因此，研究環(huán)境因子與遺傳因素相互作用對(duì)解析生物堿生物合成分子機(jī)制具有關(guān)鍵作用。

目前關(guān)于環(huán)境因子調(diào)控黃連中生物堿合成途徑關(guān)鍵基因表達(dá)的影響研究較少，對(duì)黃連的研究主要集中在化學(xué)成分分析、藥理作用機(jī)制，以及轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)黃連質(zhì)量形成關(guān)鍵基因[7-10]。此外，還有一些研究工作涉及到有效成分形成關(guān)鍵基因的克隆及其功能鑒定等方面[11-12]。通過(guò)我們前期進(jìn)行的黃連潛在地理分布預(yù)測(cè)與化學(xué)成分分析，初步預(yù)測(cè)溫差和降水為影響黃連潛在分布以及生長(zhǎng)適宜性的關(guān)鍵環(huán)境因子[13]。在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)環(huán)境脅迫結(jié)合關(guān)鍵基因表達(dá)分析，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR[14]分析不同晝夜溫差和水分下黃連生物堿合成途徑關(guān)鍵基因表達(dá)的變化，以探究晝夜溫差和水分缺失對(duì)黃連生物堿合成關(guān)鍵基因表達(dá)的影響，為進(jìn)一步揭示生物堿合成的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用的黃連植株（Coptis chinensisFranch.）材料來(lái)自于四川峨眉，選取長(zhǎng)勢(shì)良好的黃連植株進(jìn)行采樣。

1.2 晝夜溫差處理

選取生長(zhǎng)狀況及規(guī)格一致的黃連植株分為A、B、C、D 4組，每組3株。D組為對(duì)照組，將其放入生化培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)置為 22 ℃。A、B、C 3組為實(shí)驗(yàn)組，在 0～7 d 期間培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為 22 ℃，在8～14 d 設(shè)定培養(yǎng)箱溫度為 22 ℃（晝）/12 ℃（夜），15～21 d培養(yǎng)溫度為 22 ℃[15-17]，培養(yǎng)期間 A、B、C、D 4 組光照時(shí)間均為 12 h，光照強(qiáng)度為 3 000 lx。分別于第 7 d、14 d、21 d 各收集 4 組黃連樣品中一株植株，采集其根莖葉組織，用75%乙醇對(duì)收集組織樣品進(jìn)行消毒，用無(wú)菌水沖洗祛除殘余乙醇，將處理好的組織樣品存放于液氮中，用于后續(xù)RNA提取。

1.3 水分脅迫處理

選擇生長(zhǎng)狀況及規(guī)格一致的黃連植物分為A、B、C、D 4組，每組3株。D組為對(duì)照組，整個(gè)試驗(yàn)期間每?jī)商鞚惨淮嗡?，使土壤水分含量維持在55%～65%；A、B、C 3組為實(shí)驗(yàn)組，0～7 d每?jī)商鞚惨淮嗡?～14 d停止?jié)菜?，土壤水分含量維持在35%～45%，15～21 d恢復(fù)澆水，定期測(cè)定各組土壤水分含量以確定澆水量，培養(yǎng)期間光照時(shí)間均為12 h，光照強(qiáng)度為 3 000 lx，分別于第 7 d、14 d、21 d 各收集4組黃連樣品中一株植株，采集其根莖葉組織[18-19]，收集的組織樣品處理方法同1.2。

1.4 關(guān)鍵基因選擇

根據(jù)已有文獻(xiàn)[20-21]以及課題組前期進(jìn)行的黃連基因組測(cè)序和黃連有效成分代謝通路構(gòu)建工作，選擇黃連小檗堿下游生物合成途徑中的關(guān)鍵基因，包括可催化亞甲基二氧橋的形成的Cchi013261.m1、Cchi013263.m1、Cchi047971.m1和Cchi047990.m1，以及參與黃連多種生物堿合成途徑，可催化四氫化合物氧化的Cchi078208.m1和Cchi013467.m1，以黃連 18S rRNA（Genebank Accession No.DQ406855）為內(nèi)參，采用SYBR Green方法進(jìn)行實(shí)時(shí)qRT-PCR，分析關(guān)鍵環(huán)境因子脅迫條件下其表達(dá)水平變化。

1.5 總RNA提取及cDNA合成

采用天根植物總RNA提取試劑盒（RNAprep Pure Plant Kit，目錄號(hào)：DP432），按照說(shuō)明書(shū)提取黃連根、莖、葉樣品總RNA。RNA提取后用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，經(jīng)微量分光光度計(jì)檢測(cè)其純度和濃度，以檢測(cè)合格的總RNA為模板，采用TransScript? First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。

1.6 熒光定量PCR

根據(jù)前期課題組黃連基因組測(cè)序得到目的基因序列，利用Prime 5.0設(shè)計(jì)PCR引物（表1）。采用全式金 TransStart? Green qPCR SuperMix 試劑盒進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系見(jiàn)表2。熒光定量采取三步法反應(yīng)程序，94 ℃ 變性 30 s；94 ℃ 反應(yīng) 5 s，退火15 s，72 ℃ 反應(yīng) 10 s，循環(huán) 40 次，收集熒光信號(hào)，并在循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析。每個(gè)樣品均進(jìn)行三次重復(fù)。相對(duì)定量法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算2-ΔΔCt值。利用 Excel 2019 整理原始數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 7.0 繪制圖形。

表2 熒光定量PCR反應(yīng)體系

2 結(jié)果與分析

2.1 晝夜溫差和水分缺失對(duì)黃連表型的影響

黃連適宜分布于溫帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候地區(qū)，為其生長(zhǎng)提供寒冷、濕潤(rùn)和陰暗的環(huán)境條件，其生長(zhǎng)的溫度范圍為 5～34 ℃，適宜生長(zhǎng)溫度為 15～22 ℃[22]。已有研究表明溫度上下波動(dòng)10 ℃足以對(duì)黃連產(chǎn)生傷害，并且黃連對(duì)高溫變化更為敏感[23]，具有耐低溫不耐高溫的習(xí)性，本文以黃連正常適宜溫度為基礎(chǔ)，最大化研究溫差對(duì)黃連生物堿合成基因表達(dá)的影響，將溫差控制在12～22 ℃。晝夜溫差和水分缺失對(duì)黃連表型的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。如圖所示，在晝夜溫差 22 ℃（晝）/12 ℃（夜）處理后，部分黃連植株的葉片發(fā)生了不同程度的黃化，黃化的葉片呈淡綠色或淡黃色，黃化程度不高。黃連喜陰，更易在潮濕的環(huán)境中生長(zhǎng)，水分缺失對(duì)黃連生長(zhǎng)的影響較大，結(jié)果顯示，水分缺失處理之后，大部分黃連植株的葉片均發(fā)生了黃化，部分葉片的黃化程度較高，葉片呈深黃色或淺褐色，顯焦褐狀。

圖1 晝夜溫差（A）和水分缺失（B）條件下的黃連

2.2 熒光定量檢測(cè)體系的建立

本研究使用耶拿熒光定量?jī)x進(jìn)行PCR反應(yīng)。采用相對(duì)定量的方法檢測(cè)黃連生物堿生物合成途徑中 6個(gè)關(guān)鍵基因Cchi013261.m1、Cchi013263.m1、Cchi047971.m1、Cchi047990.m1、Cchi078208.m1和Cchi013467.m1，在不同脅迫條件下不同時(shí)間點(diǎn)黃連各部位的表達(dá)水平。黃連18S rRNA為內(nèi)參基因，以未經(jīng)脅迫處理，正常生長(zhǎng)的黃連作為對(duì)照樣品。圖2為6對(duì)引物的溶解曲線，均為單峰，除目的基因外，無(wú)非特異性擴(kuò)增，特異性較好，并且溶解溫度均在80 ℃左右，符合實(shí)驗(yàn)要求。

圖2 引物溶解曲線圖

2.3 基因表達(dá)結(jié)果

對(duì)黃連生物堿生物合成途徑中具有重要功能的6個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行qRT-PCR分析，不同脅迫條件下不同時(shí)間點(diǎn)黃連各部位基因表達(dá)水平變化，以未經(jīng)脅迫處理的黃連作為對(duì)照樣品，采用相對(duì)定量法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算2-ΔΔCt值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

圖3為溫差脅迫條件下黃連根（圖3A）、莖（圖3B）以及葉（圖3C）中各目的基因的表達(dá)情況，溫差脅迫以及正常處理?xiàng)l件下各目的基因在黃連不同組織部位的表達(dá)趨勢(shì)一致，表現(xiàn)為其表達(dá)量會(huì)隨著時(shí)間的推移而增加，說(shuō)明黃連不同部位受溫差脅迫的影響一致。在溫差脅迫處理后，即14 d時(shí)，A、B、C 3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中黃連不同組織部位目的基因的表達(dá)量高于對(duì)照組，這說(shuō)明晝夜溫差對(duì)黃連生物堿合成關(guān)鍵基因表達(dá)具有誘導(dǎo)作用，可對(duì)黃連生物堿合成進(jìn)行正向調(diào)控，推測(cè)晝夜溫差可能通過(guò)誘導(dǎo)這關(guān)鍵基因表達(dá)而使小檗堿的合成和積累增加。

圖3 黃連溫差處理?xiàng)l件下根（A）、莖（B）、葉（C）中目的基因的相對(duì)表達(dá)量

圖4為水分脅迫下黃連根（圖4A）、莖（圖4B）以及葉（圖4C）中各目的基因的表達(dá)情況，結(jié)果如圖所示，水分缺失以及正常水分處理?xiàng)l件下各目的基因在黃連不同組織部位中的表達(dá)趨勢(shì)一致，這與溫差脅迫處理的結(jié)果類(lèi)似。但與溫差處理?xiàng)l件下不同的是，在經(jīng)過(guò)水分缺失處理后，Cchi078208.m1和Cchi013467.m1基因表達(dá)量均高于正常澆水情況，在恢復(fù)澆水之后，其表達(dá)量反而減少，水分缺失對(duì)這兩個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)具有誘導(dǎo)作用。而目的基因Cchi013261.m1、Cchi013263.m1、Cchi047971.m1和Cchi047990.m1在黃連不同組織部位中其表達(dá)量均隨著時(shí)間的推移增加，但在經(jīng)過(guò)水分缺失處理后其表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組。說(shuō)明水分的缺失會(huì)增加催化四氫氧化物氧化的關(guān)鍵基因的表達(dá)量而使黃連有效成分的合成和積累增加，使催化亞甲基二氧橋關(guān)鍵基因的表達(dá)量降低而影響其小檗堿形成。

圖4 黃連水分缺失條件下根（A）、莖（B）、葉（C）中目的基因的相對(duì)表達(dá)量

3 結(jié)束語(yǔ)

本文通過(guò)晝夜溫差以及水分對(duì)黃連進(jìn)行脅迫處理，利用qRT-PCR對(duì)經(jīng)過(guò)脅迫處理后的黃連樣品以及對(duì)照黃連樣品中關(guān)鍵基因的表達(dá)進(jìn)行分析，分析關(guān)鍵環(huán)境因子對(duì)關(guān)鍵基因表達(dá)水平的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在脅迫條件處理后，黃連各部位中關(guān)鍵基因的表達(dá)趨勢(shì)一致。晝夜溫差處理對(duì)關(guān)鍵基因具有直接特異誘導(dǎo)的作用，而水分的缺失可能會(huì)增加Cchi078208.m1和Cchi013467.m1的表達(dá)量，會(huì)使Cchi013261.m1、Cchi013263.m1、Cchi047971.m1和Cchi047990.m1的表達(dá)量降低。黃連中有效成分的形成經(jīng)多基因調(diào)控，關(guān)鍵環(huán)境因子對(duì)其生物堿生物合成途徑中關(guān)鍵基因具有不同的調(diào)控作用，從而影響黃連質(zhì)量形成，導(dǎo)致不同產(chǎn)地黃連藥材質(zhì)量差異。