趙欣 龍臻黎 蔡林 謝遠(yuǎn)龍*

1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院，湖北 武漢 430072

2.武漢大學(xué)第一臨床學(xué)院，湖北 武漢 430072

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是不同誘導(dǎo)條件下具有多向分化潛能的多潛能干細(xì)胞，是體內(nèi)外骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的重要來(lái)源。MSCs成骨分化是一個(gè)多步驟有序發(fā)生的過(guò)程，包括成骨細(xì)胞細(xì)胞系定向分化、前成骨細(xì)胞增殖、基質(zhì)成熟、基質(zhì)礦化。成骨分化需要多種轉(zhuǎn)錄因子協(xié)調(diào)參與，MSCs通過(guò)不同細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和激素的組合或外源性信號(hào)通路的平衡激活或抑制轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子在決定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)的命運(yùn)中起著關(guān)鍵作用[1]。

可變剪接(alternative splicing，AS)最早在1978年由Walter Gibert首先描述[2]，是多細(xì)胞生物中廣泛發(fā)生的一種調(diào)控機(jī)制[3]。mRNA前體(pre-mRNAs)通過(guò)AS產(chǎn)生不同的剪接異構(gòu)體，最終形成不同功能和結(jié)構(gòu)特征的蛋白質(zhì)終產(chǎn)物。全基因組核糖核酸序列分析表明AS在MSCs中特異的表達(dá)模式有助于調(diào)控基因的表達(dá)格局，轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)錄因子的活化狀態(tài)。成骨分化過(guò)程中包括RUNX2、Sp7、Vegf-A和FosB等120余種主轉(zhuǎn)錄因子的pre-mRNAs發(fā)生AS[4]。AS控制主轉(zhuǎn)錄因子的pre-mRNAs產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)同種型在MSCs分化過(guò)程中發(fā)揮重疊、不同甚至相反的作用，精確控制分化過(guò)程有序發(fā)生，決定MSCs細(xì)胞命運(yùn)和細(xì)胞終末分化成熟的方向[5-6]，見(jiàn)表1。

表1 成骨分化中發(fā)生AS的基因Table 1 Genes containing AS in osteogenic differentiation

1 AS的生物學(xué)過(guò)程

AS在動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和生理代謝等過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。通過(guò)AS，特定外顯子被包括或排除在成熟的mRNAs之外，同一基因產(chǎn)生不同的同種型來(lái)增加蛋白質(zhì)組的多樣性。它還通過(guò)改變mRNA的穩(wěn)定性、翻譯效率、microRNA的結(jié)合位點(diǎn)或信號(hào)定位來(lái)影響轉(zhuǎn)錄本。通常認(rèn)為，AS有5種基本形式：(1)內(nèi)含子保留；(2)可變的5’剪接位點(diǎn)；(3)可變的3’剪接位點(diǎn)；(4)外顯子盒；(5)互斥外顯子(只選擇一組外顯子中的一個(gè))[19]。AS的剪接過(guò)程由多細(xì)胞動(dòng)物中最大的分子復(fù)合物剪接體催化，同時(shí)受順式作用元件和反式作用因子的調(diào)控。剪接體去除細(xì)胞內(nèi)pre-mRNA的內(nèi)含子而產(chǎn)生成熟的RNA[20]。RNA結(jié)合蛋白(RBP)以組織和發(fā)育特異性的方式表達(dá)從而決定mRNA內(nèi)是否包含給定的外顯子，以此決定同種型的比例，并通過(guò)發(fā)揮促進(jìn)或抑制剪接體與反式作用因子的作用結(jié)合，輔助剪接體識(shí)別多種順式作用元件實(shí)現(xiàn)AS。

2 AS與MSCs定向成骨分化

2.1 Runx2的可變剪接

Runx2是Runt轉(zhuǎn)錄因子家族的3個(gè)成員之一，轉(zhuǎn)錄因子Runx2的激活是建立早期成骨譜系的先決條件，并在骨細(xì)胞成熟的后期關(guān)閉。在BMSCs中Runx2通過(guò)對(duì)靶基因的調(diào)控實(shí)現(xiàn)早期激活成骨譜系抑制成脂譜系，在骨形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21]。AS使人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)表達(dá)4種不同的Runx2可變剪接亞型，包括一種完整的同種型(Runx2 wt)和3種通過(guò)跳過(guò)外顯子5或外顯子7產(chǎn)生的可變剪接同種型(Runx2Δ5，Δ7和Δ5Δ7)。Runx2的兩種截短形式(Runx2Δ5和Runx2Δ5Δ7)沒(méi)有定位在細(xì)胞核中，并且已經(jīng)失去了DNA結(jié)合活性[21]。研究發(fā)現(xiàn)，Runx2外顯子5和外顯子7都共有磷酸化位點(diǎn)但是遺漏了PY基序的共有序列，逃離了被泛素化降解的命運(yùn)。因此Runx2可能通過(guò)被磷酸化修飾改變了原有的構(gòu)象，產(chǎn)生4種有效的剪接體在成骨分化中起作用。

Runx2介導(dǎo)復(fù)雜的機(jī)制控制靶基因骨鈣素(OC)基因的轉(zhuǎn)錄。骨鈣素(OC)被認(rèn)為在骨形成的后期對(duì)成骨細(xì)胞的分化和礦化起作用。Makita等[21]研究發(fā)現(xiàn)4種亞型中只有包含外顯子5的剪接亞型，即只有Runx2 wt和Runx2Δ7才能上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞系中的OC啟動(dòng)子活性，而Runx2Δ5或Runx2Δ5Δ7亞型不能使OC啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)。此外，Runx2的各剪接體在成骨分化中的作用也受翻譯后修飾過(guò)程的影響。相比于Runx2Δ7較少受其影響，Runx2 wt與共激活子(CBP，p300)和共阻遏子(HDAC)共表達(dá)時(shí)可以使OC啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性大大增強(qiáng)。這些研究結(jié)果證實(shí)了Runx2的不同剪接體中，Runx2wt和Runx2Δ7亞型通過(guò)AS和翻譯后修飾產(chǎn)生了不同的轉(zhuǎn)錄活性，介導(dǎo)包括OC基因的靶基因的上調(diào)和下調(diào)，調(diào)控成骨的發(fā)生。值得注意的是，軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞兩種同種型(Runx2 wt和Runx2Δ7)的表達(dá)模式不同。Sinha等[22]研究表明，Runx2 wt/Runx2Δ7的比例可能是hMSCs成骨或是成軟骨細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵決定因素。此外，二者比例可能作為骨細(xì)胞癌變的潛在生物標(biāo)志物。

2.2 Sp7的可變剪接

Sp7蛋白是Sp家族的一員，Sp7受Runx2誘導(dǎo)調(diào)節(jié)成骨基因驅(qū)動(dòng)前成骨細(xì)胞分化為成熟的成骨細(xì)胞，抑制軟骨細(xì)胞分化，從而將骨祖細(xì)胞直接分化為成骨細(xì)胞[23]。Sp7通過(guò)5’位點(diǎn)處3個(gè)外顯子中前兩個(gè)外顯子發(fā)生AS，產(chǎn)生431個(gè)氨基酸編碼的長(zhǎng)蛋白同種型(Sp7L)和氨基末端截短的413個(gè)氨基酸編碼的短蛋白同種型(Sp7S)。Sp7L在成骨細(xì)胞中低表達(dá)，而Sp7S在成骨和軟骨細(xì)胞中高表達(dá)。兩種剪接體在不同細(xì)胞或組織相對(duì)豐度的不同可能與Sp7在啟動(dòng)子區(qū)域中存在的一些潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)[12]。

Sp7S轉(zhuǎn)錄起始與骨鈣素特異性元件2(OSE2)重疊[24-26]。OSE2的存在證明Runx2直接調(diào)節(jié)Sp7S的表達(dá)[26-27]。Sp7L轉(zhuǎn)錄起始與反向保守的CCAAT盒部分重疊[28]。CCAAT盒是潛在核因子Y(NF-Y)的結(jié)合位點(diǎn)，Sp7L可能受類似于骨唾液蛋白被NF-Y轉(zhuǎn)錄因子刺激的方式調(diào)節(jié)豐度[29]。值得注意的是，在發(fā)育的不同階段，如胎兒和成人骨細(xì)胞中Sp7表達(dá)量的不同可能與AS在細(xì)胞或者不同分化階段的生物學(xué)作用的差異有關(guān)[10]。

2.3 Sox9與PPARγ的可變剪接

Sox9是促進(jìn)軟骨形成和調(diào)節(jié)軟骨外細(xì)胞基質(zhì)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。最近研究發(fā)現(xiàn)，Sox9在轉(zhuǎn)錄和剪接中起著雙重作用，并且獨(dú)立于轉(zhuǎn)錄活性發(fā)揮AS作用。Sox家族共有的HMG結(jié)構(gòu)域參與了Sox9對(duì)AS的調(diào)節(jié)[30]。轉(zhuǎn)錄因子Sox9通過(guò)與副核蛋白體上的RBP蛋白p54nrb相互作用而影響軟骨形成的關(guān)鍵基因Col2A1的剪接[31]。PPARγ是成脂過(guò)程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,包括完整的同種型(PPARγ wt)和一個(gè)跳過(guò)外顯子5的較短的同種型(PPARγΔ5)。PPARγΔ5作為顯性亞型能夠降低PPARγ的活性。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)PPARγΔ5改變了PPARγ誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)從而降低MSCs成脂分化的能力[32]。MSCs早期形成前成骨細(xì)胞的關(guān)鍵是抑制成軟骨和成脂發(fā)育，AS通過(guò)控制Runx2、Sox9、PPARγ等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的AS，影響信號(hào)通路的傳導(dǎo)方向，在這一過(guò)程中起著重要作用。例如著名的Wnt信號(hào)通路通過(guò)AS抑制PPARγ且激活Runx2有效亞型的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抑制成脂激活成骨譜系。

3 AS與細(xì)胞增殖、基質(zhì)成熟和基質(zhì)礦化

3.1 OPN的可變剪接

骨橋蛋白(OPN)是骨基質(zhì)中較豐富的非膠原蛋白之一，在類骨質(zhì)形成和基質(zhì)礦化中起著重要作用。OPN通過(guò)AS產(chǎn)生3種剪接亞型，包括全長(zhǎng)同種型OPNa，缺失外顯子5的OPNb (ΔE5)和缺失的外顯子4的OPNc(ΔE4)[10]。Grace等[22]首次證實(shí)OPNa和OPNc在體內(nèi)通過(guò)增加動(dòng)脈生成不同程度地促進(jìn)功能性缺血后新生血管的形成，促進(jìn)成骨分化。

3.2 c-Fos的可變剪接

AP-1轉(zhuǎn)錄因子家族是由Fos- (c-Fos，F(xiàn)osB，ΔFosB，F(xiàn)ra-1 and Fra-2)和Jun相關(guān)(cJun，JunB and JunD)蛋白組成的二聚體復(fù)合物，通過(guò)與靶基因啟動(dòng)子上的特定序列相互作用來(lái)調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄[23]，其中c-Fos是體內(nèi)破骨-巨噬細(xì)胞譜系的關(guān)鍵調(diào)控因子。c-Fos通過(guò)AS產(chǎn)生兩種剪接亞型，包括去掉內(nèi)含子3的c-Fos和保留內(nèi)含子3的c-Fos-2。c-Fos通過(guò)RANKL-RANK信號(hào)通路激活破骨細(xì)胞吸收類骨質(zhì)使得成骨細(xì)胞在骨陷窩中形成骨[24]。研究發(fā)現(xiàn)c-Fos-2轉(zhuǎn)錄物在體內(nèi)或體外以相當(dāng)高的速率無(wú)處不在地合成，且數(shù)量高于或類似于編碼其他Fos家族成員。同時(shí)內(nèi)含子3賦予c-fos-2約6倍的顯著的去穩(wěn)定作用。值得注意的是，兩種c-fos剪接體合成或降解速率的快速變化導(dǎo)致其相對(duì)比例的快速而短暫的變化，它們的協(xié)同微調(diào)與其在成骨分化中的生理功能相關(guān)還需進(jìn)一步研究[25]。

3.3 FosB的可變剪接

FosB屬于AP-1轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，參與骨細(xì)胞增殖和分化的調(diào)節(jié)。FosB轉(zhuǎn)錄物通過(guò)在盒式外顯子處的AS產(chǎn)生一種天然存在的FosB的截短形式ΔFosB。ΔFosB在轉(zhuǎn)基因小鼠中過(guò)度表達(dá)時(shí)會(huì)抑制MSCs成脂分化，誘導(dǎo)整個(gè)骨骼的骨形成增加從而使得骨硬化，同時(shí)ΔFosB在骨細(xì)胞機(jī)械負(fù)荷誘導(dǎo)的信號(hào)通路中也很重要[26-27]。Δ2ΔFosB是FosB的另一個(gè)截短的同種型，它通過(guò)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號(hào)通路增強(qiáng)信號(hào)的傳遞，并誘導(dǎo)整個(gè)骨骼中骨形成的增加[28]。研究證明[29]ΔFosB與Δ2ΔFosB通過(guò)形成的帶有JunD的異二聚體復(fù)合物上調(diào)成骨細(xì)胞分化早期標(biāo)志物、下調(diào)成脂細(xì)胞分化早期標(biāo)志物的表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)成骨分化的作用。

4 AS與其他成骨分化有關(guān)基因

4.1 Vegf-A的可變剪接

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(Vegf-A)是一種多功能生長(zhǎng)因子，它通過(guò)自分泌促進(jìn)礦化和旁分泌促進(jìn)血管生成的方式來(lái)促進(jìn)BMSCs的成骨分化[30]。在嚙齒動(dòng)物中，Vegfa包含3種同源剪接變體：Vegf-a120、164和188[31]。Vegf-a120是最短的變體，在促進(jìn)BMSCs的生長(zhǎng)方面效果較差。Vegf-a164在促進(jìn)BMSCs增殖和軟骨分化方面起調(diào)節(jié)作用，而Vegf-a188在促進(jìn)BMSCs成骨分化方面更有效[32]。Tian等[12]研究表明，嚙齒動(dòng)物Vegfa產(chǎn)生差異性生物活性剪接亞型與m6A甲基轉(zhuǎn)移酶Mettl3有關(guān)，敲除Mettl3雖然不會(huì)顯著改變Vegf-a120的基因水平，但Vegf-a164和188在內(nèi)的與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和分化有關(guān)的基因水平顯著降低。另一項(xiàng)研究顯示[13]，Vegf-A的可變剪接與機(jī)械應(yīng)力相關(guān)，不同頻率的機(jī)械應(yīng)力控制Vegf-A在盒式外顯子(6A、6B和7)處發(fā)生AS產(chǎn)生6種不同的剪接亞型。其中Vegf-Awt、Vegf-A206、189和165在高頻機(jī)械應(yīng)力下高表達(dá)，反之低頻機(jī)械應(yīng)力下高表達(dá)的Vegf-A145和121中Vegf-A121被分泌而Vegf-A145結(jié)合于基底膜。上述不同亞型的分布證明了高機(jī)械應(yīng)力刺激膜結(jié)合的Vegf-A亞型上調(diào)，而低機(jī)械應(yīng)力使得分泌的Vegf-A亞型上調(diào)。這為調(diào)節(jié)成骨分化提供了一種新的思路，即可以通過(guò)改變機(jī)械應(yīng)力來(lái)改變Vegf-A亞型，達(dá)到局部微循環(huán)重建和血管密度增加以再生骨的目的，為骨的創(chuàng)傷愈合治療提供了一個(gè)新的分子靶點(diǎn)。

4.2 NELL-1的可變剪接

NELL-1被稱為神經(jīng)表皮生長(zhǎng)樣(NEL)樣因子1(NELL-1)，在體內(nèi)和體外促進(jìn)MSCs成骨[33]。該基因有兩種亞型，包括含有810個(gè)氨基酸的野生型NELL-1810和在外顯子2的5’剪接位點(diǎn)處發(fā)生AS使N端截短240個(gè)氨基酸的亞型NELL-1570。雖然兩種亞型都能夠表現(xiàn)出成骨分化效應(yīng)，但NELL-1810是在胚胎骨骼發(fā)育中起重要作用，而NELL-1570是在出生后表達(dá)并誘導(dǎo)成骨分化；野生型NELL-1810僅表現(xiàn)出對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖有限的刺激，而NELL-1570能夠顯著刺激多種BMSCs樣群體的增殖和成骨分化[14]。然而，目前NELL-1可變剪接的分子機(jī)制仍不清楚，還有待進(jìn)一步研究。

4.3 AMBN的可變剪接

成釉蛋白(AMBN)是一種在間充質(zhì)和上皮細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，是編碼成骨分化的調(diào)節(jié)劑[34]。AMBN的pre-mRNA通過(guò)外顯子6的3’剪接位點(diǎn)處發(fā)生AS，產(chǎn)生AMBNwt和截短15個(gè)氨基酸肽的AMBNΔ61-15，二者都具有促進(jìn)MSCs增殖和釉質(zhì)形成的功能[7]。最近研究表明，由AMBN外顯子5序列衍生的合成肽(Ex5)可以促進(jìn)hMSC增殖并激活Runx2和Sp7的表達(dá)。Ex5單獨(dú)作為MSCs的增殖信號(hào)甚至比整個(gè)AMBNwt分子更有效。有趣的是，Ex5這種效應(yīng)被外顯子6起點(diǎn)處的15氨基酸肽(Q9NP70)所抑制，而Q9NP70又有與Ex5相同的增強(qiáng)hMSC分化和細(xì)胞外礦化標(biāo)志物分泌的積極作用[15]。目前AS對(duì)ABMN外顯子5/6和各種分子衍生亞型的調(diào)控機(jī)制仍有待闡明，但可以肯定的是AMBN的AS似乎對(duì)編碼AMBN細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、AMBN的自組裝和hMSC的增殖分化有很大的的意義，特別是在成骨方面很重要[7]。

4.4 POSTN的可變剪接

骨膜素(Postn，PN，OSF-2)是一種分泌性細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白。AS發(fā)生于Postn外顯子16-23處的C末端區(qū)，產(chǎn)生Postn-001和Postn-001-008兩種剪接亞型[16]。Postn-001包括數(shù)量最大的RD結(jié)構(gòu)域，發(fā)揮增強(qiáng)成骨分化的作用。相比之下，Postn-001-008包括有不同數(shù)量的RD結(jié)構(gòu)域，能夠增加骨膜中成骨細(xì)胞的附著[17]。有研究報(bào)道，在脊椎動(dòng)物中Postn在AS位點(diǎn)即C末端區(qū)顯示出逐漸進(jìn)化的可塑性，該區(qū)域可能作為Postn發(fā)揮不同生物學(xué)功能的基礎(chǔ)[18]。

4.5 Col9a1和CDKN2A的可變剪接

Col9a1是一個(gè)典型的軟骨基因，通過(guò)AS產(chǎn)生兩種剪接亞型，包括發(fā)生于外顯子1的Col9a1-201和跳過(guò)外顯子6的Col9a1-202。Col9a1-202缺少N末端層黏連蛋白G結(jié)構(gòu)域，與骨再生有關(guān)。CDKN2A基因也稱多重腫瘤抑制基因，剪接產(chǎn)生CDKN2A-201和CDKN2A-202。剪接體201/202的比例控制細(xì)胞周期進(jìn)程，調(diào)控骨密度和成骨分化[4]。目前對(duì)于AS對(duì)Col9a1和CDKN2A的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。此外，Khayal等[4]通過(guò)二代測(cè)序，分別對(duì)第0、3、6、12天不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)發(fā)生AS的基因各剪接亞型表達(dá)含量變化進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明，包括Agbl5、Pdzd7、Wnk1等120余種基因在骨分化過(guò)程中發(fā)生AS。

5 展望

以往對(duì)調(diào)控MSCs成骨分化的分子機(jī)制的研究主要集中在轉(zhuǎn)錄調(diào)控上。然而，最近的發(fā)現(xiàn)揭示了AS在MSCs成骨分化和功能中被低估的作用。本綜述總結(jié)了AS在成骨分化中調(diào)控Runx2、Sp7等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子剪接的機(jī)制，以及產(chǎn)生的各剪接亞型在MSCs細(xì)胞增殖和決定細(xì)胞命運(yùn)中的作用?？偨Y(jié)了AS調(diào)控成骨分化的3種重要方式：(1)通過(guò)激活pre-mRNA特異性轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)或是拮抗wt蛋白的功能從而表達(dá)特異性的蛋白同種型；(2)通過(guò)控制同種型亞細(xì)胞定位和它與其他分子(如核糖核酸-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì))間的相互作用，微調(diào)同種型表達(dá)的平衡以確保MSCs的分化；(3)控制不同類型的RBPs在時(shí)間與空間上特異性表達(dá)，調(diào)控剪接體與剪接位點(diǎn)的結(jié)合從而實(shí)現(xiàn)AS。

目前為止，大多數(shù)關(guān)于AS與成骨分化的報(bào)道局限于體外人工培養(yǎng)的研究中。對(duì)于AS在成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控上仍有許多未知值得探索。如何更詳細(xì)地闡明AS體內(nèi)確切的分子功能和機(jī)制，加深A(yù)S在成骨方面的認(rèn)識(shí)，使未來(lái)臨床骨創(chuàng)傷、骨修復(fù)等治療方面取得新突破將成為研究重點(diǎn)。