劉蔚楠 周曉霞 朱瑋 章靚 林家鐘 林翔 王榮茂 張燕 戴燕鈴

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院骨傷科，福建 福州 350004

2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院藥學(xué)部，福建 福州 350004

3.中醫(yī)骨傷及運(yùn)動(dòng)康復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(福建中醫(yī)藥大學(xué))，福建 福州 350122

4.福建中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院，福建 福州 350122

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是一種與增齡相關(guān)的疾病，絕經(jīng)后女性由于雌激素水平迅速下降，成骨與破骨間的動(dòng)態(tài)平衡被打破，出現(xiàn)骨量減少及骨組織結(jié)構(gòu)變化，從而導(dǎo)致PMOP的發(fā)生[1]。目前我國(guó)人口老齡化日趨嚴(yán)重，是世界上老年人口最多的國(guó)家，PMOP已成為我國(guó)面臨的重要公共健康問(wèn)題。它會(huì)引起全身慢性疼痛、多部位的脆性骨折甚至死亡，嚴(yán)重影響了老年人的生活質(zhì)量，給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前PMOP的臨床用藥以西藥為主、中藥為輔，西醫(yī)治療用藥主要包括激素替代療法(HRT)、雙膦酸鹽、降鈣素等。西藥在治療上雖有規(guī)范明確的指南，但不少藥物都有明顯的副作用，如惡心嘔吐、頭暈乏力、胃腸道不適、激素依賴性腫瘤等，停藥后骨量會(huì)隨之迅速下降[2-5]。

近年來(lái)，中醫(yī)藥在防治PMOP方面積累了豐富的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，且多數(shù)學(xué)者[6]認(rèn)為中藥通過(guò)對(duì)機(jī)體多途徑、多通路、多靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)，取得了較為肯定的療效，實(shí)現(xiàn)標(biāo)本同治，在防治PMOP領(lǐng)域具有巨大的潛力。本團(tuán)隊(duì)前期臨床研究[7-8]表明，益腎健骨膏能夠有效減輕PMOP患者的疼痛，提高腰椎骨密度，降低Ⅰ型膠原蛋白C端肽水平，且未出現(xiàn)胃腸道不良反應(yīng)，但其相關(guān)作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究擬用益腎健骨膏干預(yù)去勢(shì)大鼠，探討益腎健骨膏對(duì)改善PMOP骨密度和骨代謝的效果及其潛在作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供進(jìn)一步的理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)雌性SD大鼠50只，3月齡，體重(250±20)g，購(gòu)自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(閩)2016-0002，飼養(yǎng)于福建省中醫(yī)藥科學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，溫度22 ℃～24 ℃，濕度40 %～70 %，每日人工光源12 h明暗交替。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)福建省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：FJATCM-IAEC2020004)

1.1.2藥品：阿侖膦酸鈉維D3購(gòu)自石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，批號(hào)271190202；注射用青霉素購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)10122008163；益腎健骨膏(批號(hào)：200727)，由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院制劑室提供，主要組成：杜仲、淫羊藿、菟絲子、黃精、骨碎補(bǔ)、當(dāng)歸、熟地、巴戟天、補(bǔ)骨脂、枸杞、山藥等，水煎過(guò)濾，濃縮至500 mL藥液(每毫升相當(dāng)于1.3 g原生藥的藥液)，即高劑量膏方組濃度。低劑量膏方組取益腎健骨膏藥液100 mL加水稀釋至600 mL(每毫升相當(dāng)于0.2 g原生藥的藥液)。

1.1.3主要試劑和儀器：主要試劑：戊巴比妥鈉(Sigma公司，批號(hào)AM00469)，RNA提取液(Thermo，貨號(hào)15596026)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(近岸蛋白質(zhì)科技有限公司，貨號(hào)E047-01B)，QPCR試劑盒(近岸蛋白質(zhì)科技有限公司，貨號(hào)E096-01A)，Notch1 (D1E11) XP Rabbit mAb(CST公司，貨號(hào)3608)，Notch2 (D76A6) XP Rabbit mAb(CST公司，貨號(hào)5732)，Jagged2 (C23D2) Rabbit mAb(CST公司，貨號(hào)2210)，Jagged1 Polyclonal Antibody(immunoway公司，貨號(hào)YT6212)，耐酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)、骨保護(hù)素(OPG)、Ⅰ型前膠原氨基端原肽(PINP)、Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基端肽(CTX-Ⅰ)檢測(cè)試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司，貨號(hào): SEA902Ra、SEA108Ra、CEA957Ra、CEA665Ra)；主要儀器：雙能X射線骨密度儀(美國(guó)HOLOGIC，型號(hào)：DISCOVERY W型)、熒光定量PCR儀(ABI公司，型號(hào)：Stepone plus)、(450±10)nm濾光片的酶標(biāo)儀(BioTek公司，型號(hào)ELx808)、萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)(日本島津公司IG-A1000 N)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物造模及分組、給藥：50只3月齡雌性SD大鼠喂養(yǎng)2個(gè)月后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、高劑量膏方組、低劑量膏方組、陽(yáng)性藥物組,每組10只。禁食12 h后經(jīng)大鼠腹腔注射2 %戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉，假手術(shù)組大鼠暴露卵巢但不切除，其余各組大鼠采用一次性切除雙側(cè)卵巢的方法造模[9]，術(shù)后連續(xù)3 d給予8萬(wàn)U青霉素預(yù)防感染。造模成功后，假手術(shù)組、模型組給予10 mL/(kg·d)生理鹽水灌胃，低、高劑量膏方組分別給予2 g/(kg·d)、13 g/(kg·d)益腎健骨膏灌胃，陽(yáng)性藥物組灌服6.25 mg/(kg·w)阿倫膦酸鈉維D3片[10]，各組均持續(xù)干預(yù)12周。每周記錄大鼠的體重，根據(jù)體重調(diào)整灌胃量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，假手術(shù)組死亡1只，其他組大鼠均存活。

1.2.2取材：干預(yù)12周后，所有大鼠禁食不禁水12 h，用2 %戊巴比妥鈉(45 mg/kg)經(jīng)大鼠腹腔注射麻醉后，取腹主動(dòng)脈血5 mL，3 000 r/min離心15 min，取血清，保存于-80 ℃冰箱備用。分離大鼠L4、L5腰椎，用生理鹽水濕潤(rùn)的紗布包裹，外層再予錫紙包好后置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3大鼠腰椎骨密度、最大壓縮載荷測(cè)定：采用骨密度儀檢測(cè)腰椎L4的骨密度，選擇高分辨模式，行間距0.07 cm，點(diǎn)分辨率為0.062 2 cm，6.10×0.10 Coll，140/100 kVp。萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)對(duì)腰椎L4進(jìn)行椎體壓縮(加載速度為1 mm/min)，記錄最大壓縮載荷。

1.2.4血清骨代謝指標(biāo)檢測(cè)：大鼠腹主動(dòng)脈采血，以3 000 r/min離心15 min，取上層血清，Elisa法檢測(cè)血清TRACP、OPG、PINP，CTX-Ⅰ水平。

1.2.5PCR法檢測(cè)Notch通路及OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)的基因表達(dá)：用液氮研磨凍存的大鼠L5腰椎組織，按照試劑盒依次提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)OPG、RANKL、RANK、TRAF 6、Notch 1、Notch 2、Jagged 1、Jagged 2的 mRNA表達(dá)。引物由福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成，詳見(jiàn)表1。DNA擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min后進(jìn)入PCR循環(huán)，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果以2-△△Ct表示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence of PCR

1.2.6Westbern blot檢測(cè)骨組織Notch通路的蛋白表達(dá)：將50 mg腰椎組織加入液氮研磨，提取總蛋白，上樣電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫封閉2 h，分別加入稀釋的Notch 1、Notch 2、Jagged 1、Jagged 2一抗(1∶1 000), 4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后3次,加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h。TBST洗膜后,ECL顯影曝光，Photoshop整理去色，Image J軟件分析條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 益腎健骨膏對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠腰椎最大壓縮載荷及骨密度的影響

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腰椎壓縮最大載荷及骨密度顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，低劑量膏方組腰椎壓縮最大載荷及骨密度變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而高劑量膏方組和陽(yáng)性藥物組顯著升高(P<0.05)，高劑量膏方組和陽(yáng)性藥物組在腰椎壓縮最大載荷及骨密度方面接近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2、圖1。

表2 各組大鼠腰椎壓縮最大載荷及骨密度Table 2 The maximum compressive load of lumbar spine and bone mineral density of the rats in each group

2.2 益腎健骨膏對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝標(biāo)志物的影響

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠TRACP、CTX-Ⅰ水平顯著升高，而PINP、OPG水平顯著降低(P<0.05)；治療3個(gè)月后，與模型組比較，低劑量膏方組骨代謝物水平無(wú)明顯變化(P>0.05)，而高劑量膏方組和陽(yáng)性藥物組TRACP、CTX-Ⅰ水平顯著降低，而PINP、OPG水平顯著升高(P<0.05)；高劑量膏方組和陽(yáng)性藥物組TRACP和OPG水平無(wú)明顯差異(P>0.05)，高劑量膏方組CTX-Ⅰ水平高于陽(yáng)性藥物組，而PINP低于陽(yáng)性藥物組(P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清PINP、OPG、TRACP、CTX-Ⅰ水平Table 3 The serum levels of PINP, OPG, TRACP and CTX-Ⅰ in each

2.3 益腎健骨膏對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織Notch通路的影響

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腰椎Notch 1、Notch 2及其配體Jagged 1、Jagged 2的mRNA及蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，低劑量膏方組、高劑量膏方組和陽(yáng)性藥物組Notch 1、Notch 2、Jagged 1、Jagged 2的mRNA及蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表4和圖2。

表4 各組大鼠Notch 1、Notch 2、Jagged 1 and Jagged 2基因表達(dá)Table 4 Relative mRNA levels of Notch 1, Notch 2, Jagged 1 and Jagged 2 in each

2.4 益腎健骨膏對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)基因表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腰椎OPG的mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，而RANKL、RANK及下游TRAF 6的mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，低劑量膏方組OPG的mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)，RANKL、RANK及下游TRAF 6的mRNA表達(dá)顯著減少(P<0.05)；與模型組比較，高劑量膏方組和陽(yáng)性藥物組腰椎OPG的mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05)，而RANKL、RANK及下游TRAF 6的mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與高劑量膏方組比較，陽(yáng)性藥物組腰椎OPG的mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05)，RANKL、RANK的mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)，下游TRAF 6的mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)基因表達(dá)Table 5 Relative mRNA expression levels of OPG/RANKL/RANK in each

3 討論

中醫(yī)學(xué)將絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥歸屬為“骨痿”范疇，主要是由于絕經(jīng)后女性腎精不足導(dǎo)致骨失滋養(yǎng)的全身性慢性骨骼疾病。中醫(yī)認(rèn)為，PMOP的關(guān)鍵病機(jī)以腎精虧虛為主，兼顧脾虛和血瘀，臨床治療以“改善臨床癥狀，延緩骨量丟失，或增加骨量，降低骨折風(fēng)險(xiǎn)，提高生存質(zhì)量”為目的，遵循補(bǔ)腎益精、健脾益氣、活血祛瘀的基本治則[6]。近年來(lái)研究[11]顯示，中藥治療PMOP主要表現(xiàn)為類雌激素樣作用，能有效提高雌激素，抑制骨吸收，促進(jìn)骨形成，從而達(dá)到防治PMOP的療效。目前療效較為明確的單味中藥包括杜仲、骨碎補(bǔ)、淫羊藿、補(bǔ)骨脂、葛根、丹參等，中成藥有左歸丸、金天格膠囊(肝腎陰虛證)，右歸丸、仙靈骨葆膠囊(脾腎陽(yáng)虛證)，骨疏康顆粒/膠囊、壯骨止痛膠囊(腎虛血瘀證)[6,12]。流行病學(xué)調(diào)查[13]顯示，PMOP的中醫(yī)證型腎虛證高達(dá)84.7 %，治療PMOP的藥物歸經(jīng)主要以肝腎居首。近年來(lái)多項(xiàng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)[14-16]顯示補(bǔ)腎法是治療PMOP的根本大法，補(bǔ)腎中藥可以改善PMOP患者的VAS評(píng)分、骨密度、骨代謝以及脆性骨折發(fā)生率等指標(biāo)，其臨床療效確切，且無(wú)不良事件。

益腎健骨膏為福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院治療骨質(zhì)疏松癥的經(jīng)驗(yàn)方，現(xiàn)已作為協(xié)定成方廣泛應(yīng)用于臨床。益腎健骨膏以“補(bǔ)益肝腎、活血化瘀”為組方原則，方中杜仲、續(xù)斷、骨碎補(bǔ)、巴戟天具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的作用，加用菟絲子、山茱萸、枸杞、黃精可增強(qiáng)補(bǔ)益肝腎的作用，佐以當(dāng)歸、熟地、丹參、牛膝可活血化瘀、益精填髓。益腎健骨膏諸藥合用共奏補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨、活血通絡(luò)之效，使骨有所充、髓有所化、筋有所養(yǎng)。且“滋膏”的劑型是治療慢性疾患的最佳劑型，適合PMOP患者長(zhǎng)期滋補(bǔ)服用。本研究結(jié)果表明，高劑量的益腎健骨膏可以顯著提高PMOP模型大鼠的骨密度、骨強(qiáng)度及骨形成指標(biāo)，且降低骨吸收指標(biāo)水平，與前期臨床研究結(jié)果一致，再次證實(shí)益腎健骨膏在調(diào)節(jié)PMOP骨代謝水平，促進(jìn)骨重建方面的顯著療效。

Notch信號(hào)通路骨代謝和骨重建方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用, 可影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化和平衡，是治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的新靶點(diǎn)[17-18]。Canalis E[19]的研究表明，骨細(xì)胞中Notch1表達(dá)顯著增加了小鼠血清OPG的含量，以抑制骨吸收引起骨量的增加。多項(xiàng)中醫(yī)補(bǔ)腎方干預(yù)PMOP大鼠后顯示，對(duì)Notch通路的Notch 1、Jagged 1、HES蛋白表達(dá)起正向調(diào)節(jié)作用,促進(jìn)骨形成,改善了PMOP的癥狀[20-22]。本研究顯示，PMOP模型大鼠的Notch 1、Notch 2、Jagged 1、Jagged 2的mRNA、蛋白表達(dá)均顯著降低，益腎健骨膏治療后，上述基因的mRNA、蛋白表達(dá)顯著升高，說(shuō)明益腎健骨膏可能通過(guò)影響Notch通路，促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收，進(jìn)而減少骨量丟失。

OPG/RANKL/RANK軸與PMOP的發(fā)生密切相關(guān)，它是雌激素受體激活通路的下游信號(hào)通路，OPG是抑制骨吸收、增加骨密度和骨強(qiáng)度的關(guān)鍵細(xì)胞因子。OPG與RANKL分別作用于OC和OB，OPG通過(guò)與RANK競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合RANKL起到調(diào)控骨代謝信號(hào)通路的作用。若OPG/RANKL/RANK信號(hào)表達(dá)失衡，則破骨活性增強(qiáng)，形成負(fù)性骨平衡狀態(tài)而導(dǎo)致PMOP的發(fā)生[23-24]。高城翰等[14]的Meta分析表明補(bǔ)腎法在調(diào)節(jié)PMOP動(dòng)物模型的OPG/RANK/RANKL信號(hào)通路方面具有重要優(yōu)勢(shì)。本研究結(jié)果顯示，PMOP模型大鼠腰椎OPG的mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，而RANKL、RANK及下游TRAF 6的mRNA表達(dá)顯著增加，而高劑量益腎健骨膏干預(yù)后，大鼠腰椎OPG的mRNA表達(dá)顯著增加，同時(shí)RANKL、RANK及下游TRAF 6的mRNA表達(dá)降低，提示益腎健骨膏可能通過(guò)OPG/RANKL/RANK軸抑制了骨吸收，減少骨量丟失。

綜上所述，基于“補(bǔ)益肝腎、活血化瘀”治療原則組方的益腎健骨膏，能夠有效增強(qiáng)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度和骨強(qiáng)度，調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收的代謝平衡，其作用機(jī)制可能與干預(yù)了Notch通路及OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)密切相關(guān)，為臨床應(yīng)用提供了進(jìn)一步的理論支持。