楊丹丹，章 輝，陳芳林△

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院：1.藥學(xué)部；2.口腔科，江蘇南京 210019)

順鉑作為一種抗腫瘤藥物在臨床上應(yīng)用廣泛，但伴有心臟毒性、腎毒性和肝毒性等。研究報(bào)道，順鉑引起的心臟毒性主要表現(xiàn)為心律失常、急性心肌梗死、室上性心動(dòng)過(guò)速和心房顫動(dòng)等[1-4]。心臟毒性事件最終可導(dǎo)致充血性心力衰竭和心源性猝死。因此，亟需尋找一種有效的心臟毒性治療策略，而了解導(dǎo)致心臟毒性的機(jī)制有助于開(kāi)發(fā)預(yù)防順鉑相關(guān)毒性作用的新方法和手段。五味子多糖(schisandra chinensls polysaccharide，SCP)是五味子的一種組成成分，研究顯示五味子及其活性成分五味子乙素與丙素具有抗炎、抗內(nèi)皮損傷和抗心肌肥厚等藥理活性[5-9]。這提示SCP可能也具有心血管保護(hù)作用。因此，本研究利用順鉑誘導(dǎo)心臟損傷的小鼠動(dòng)物模型探討SCP對(duì)順鉑誘導(dǎo)心臟損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇8周齡的雄性C57BL/6小鼠18只，體重18～22 g，購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2018-0008]。所有動(dòng)物護(hù)理和實(shí)驗(yàn)程序均按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》中相關(guān)建議進(jìn)行，且所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均得到南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.2主要儀器與試劑

順鉑購(gòu)自江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司(生產(chǎn)批號(hào)：190701)；SCP購(gòu)自南京春秋生物工程有限公司(生產(chǎn)批號(hào)：HHQS20181110)；蘇木素、伊紅均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司(生產(chǎn)批號(hào)：183933、ZH192405)；乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒、肌酸激酶同工酶(CK-MB)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成科技有限公司(生產(chǎn)批號(hào)：20200619、20200620)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green均購(gòu)自翌圣生物科技(上海)股份有限公司(生產(chǎn)批號(hào)：H1901121、H1901121)；核因子-κB(NF-κB)、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)一抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司(生產(chǎn)批號(hào)：2013-01-09、2013-12-09)；α-Tubulin一抗購(gòu)自美國(guó)Proteintech group公司(生產(chǎn)批號(hào)：00069967)。電泳儀PowerPac Basic購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；正置熒光顯微鏡DM2000購(gòu)自德國(guó)Leica公司；定量PCR(qPCR)儀LC96購(gòu)自美國(guó)Roche公司；酶標(biāo)儀Multiskan FC購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)5200購(gòu)自浙江天能科技有限公司；超高分辨率小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)Vevo 3100LT購(gòu)自加拿大富士VisualSonics公司。

1.2 方法

1.2.1小鼠模型的建立

參考文獻(xiàn)[9-10]建模，單次腹腔注射順鉑3 mg/kg(溶于磷酸緩沖液，pH=7.2)誘導(dǎo)小鼠心臟損傷。

1.2.2分組與給藥

將18只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為3組：生理鹽水組、順鉑組、順鉑+SCP組，每組6只。參考文獻(xiàn)[11-12]的處理方式：生理鹽水組小鼠腹腔注射生理鹽水前7 d灌胃給予1%羧甲基纖維素鈉溶液，每天1次，單次腹腔注射生理鹽水后7 d繼續(xù)每天灌胃給予1%羧甲基纖維素鈉溶液；順鉑組小鼠腹腔注射順鉑前7 d灌胃給予1%羧甲基纖維素鈉溶液，每天1次，單次腹腔注射順鉑3 mg/kg后7 d繼續(xù)每天灌胃給予1%羧甲基纖維素鈉溶液；順鉑+SCP組小鼠腹腔注射順鉑前7 d灌胃給予SCP(1%羧甲基纖維素鈉溶液配制成混懸液)20 mg/kg，每天1次，單次腹腔注射順鉑后7 d繼續(xù)每天給予SCP 20 mg/kg。

1.2.3小鼠心功能檢測(cè)

單次腹腔注射順鉑7 d后通過(guò)超高分辨率小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)Vevo 3100LT檢測(cè)心功能。根據(jù)M樣波形圖評(píng)價(jià)左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮末期容積(LVESV)和左室舒張末期容積(LVEDV)。射血分?jǐn)?shù)(EF)=(LVEDV-LVESV)/LVEDV×100%，縮短分?jǐn)?shù)(FS)=(LVIDd-LVIDs)/LVIDd×100%。

1.2.4心臟組織染色

戊巴比妥鈉麻醉處死小鼠取心臟組織，4%多聚甲醛固定并于石蠟包埋。分別按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行染色，石蠟切片(5 μm)用蘇木素-伊紅(HE)染色評(píng)價(jià)心臟損傷程度，免疫組織化學(xué)染色評(píng)價(jià)心臟組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達(dá)水平。

1.2.5生化指標(biāo)測(cè)定

戊巴比妥鈉麻醉處死小鼠，收集小鼠血液，用相應(yīng)的試劑盒檢測(cè)血清LDH與CK-MB水平。

1.2.6RNA提取與mRNA水平檢測(cè)

各組6只小鼠處死后取心臟組織約20 mg，Trizol研磨，加入氯仿，震蕩15 s，室溫靜置10 min，4 ℃ 12 000×g離心15 min，取上清液，加入0.5 mL異丙醇，上下顛倒10次，靜置10 min，4 ℃ 12 000×g離心10 min，棄上清液，加入1 mL 75%乙醇，上下顛倒10次，靜置10 min，4 ℃ 7 500×g離心5 min，棄上清液后75%乙醇吸凈殘余，DEPC水溶解提取的RNA，Nanodrop測(cè)量RNA水平。用2×Super Mix將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，獲得的cDNA用SYBR Green通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測(cè)炎癥因子[白細(xì)胞介素(IL)-6、TNF-α、高遷移率族蛋白1(HMGB1)和IL-1β]mRNA表達(dá)水平，引物序列見(jiàn)表1。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)步驟：(1)將反應(yīng)體系(1 μL cDNA+1 μL 10 μmol/L正向引物+1 μL 10 μmol/L反向引物+5 μL SYBR Green+2 μL無(wú)RNase雙蒸水)加至無(wú)RNAase的PCR八連管中；(2)將八連管蓋緊，離心后上機(jī)，按照如下程序進(jìn)行，95 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；添加設(shè)備默認(rèn)設(shè)置的溶解曲線設(shè)定。以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法分析IL-6、TNF-α、HMGB1和IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.2.7Western blot檢測(cè)NF-κB的磷酸化水平

各組6只小鼠處死后取心臟組織20～40 mg裂解，測(cè)蛋白水平并配平，以20 μL體積100 μg總蛋白樣上。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，濕法轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，分子量≤70×103的蛋白用0.2 μm孔徑的膜，分子量>70×103的蛋白用0.45 μm孔徑的膜。90 min后5%脫脂牛奶封閉，TBST洗膜3次，每次5 min，再加入NF-κB一抗(5%脫脂奶粉的TBST溶液以1∶1 000稀釋)、p-NF-κB(5% BSA的TBST溶液以1∶1 000稀釋)、α-Tubulin(5%脫脂奶粉的TBST溶液以1∶1 000稀釋)，室溫?fù)u床2 h后移至4 ℃孵育過(guò)夜。次日，TBST洗膜3次，每次5 min，隨后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，TBST洗滌3次。加電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)液(A液與B液1∶1)避光孵育2 min，曝光儀成像，利用ImageJ軟件做圖像灰度值統(tǒng)計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 SCP改善順鉑誘導(dǎo)的小鼠心功能障礙與心臟損傷

心功能結(jié)果顯示：相較于生理鹽水組，順鉑組小鼠心臟EF和FS均明顯下降，且血清LDH與CK-MB水平均明顯升高(P<0.05)；相較于順鉑組，SCP+順鉑組小鼠心臟EF和FS均明顯升高，血清LDH與CK-MB水平均明顯降低(P<0.05)；3組小鼠心臟LVIDs、LVIDd、LVESV、LVEDV比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2、3。

表2 3組小鼠心功能指標(biāo)比較

表3 3組小鼠血清LDH與CK-MB水平比較

2.2 SCP對(duì)順鉑引起的心肌纖維紊亂有保護(hù)作用

HE染色結(jié)果顯示：相較于生理鹽水組，順鉑組小鼠心肌纖維雜亂而不連續(xù)，而順鉑+SCP組小鼠心肌纖維有序而連續(xù)，見(jiàn)圖1。

A：生理鹽水組；B：順鉑組；C：順鉑+SCP組。

2.3 SCP抑制順鉑誘導(dǎo)的心肌炎癥

相較于生理鹽水組，順鉑組小鼠心肌組織IL-6、TNF-α、HMGB1和IL-1β的mRNA表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)；相較于順鉑組，順鉑+SCP組小鼠心肌組織上述各炎癥因子的mRNA表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)表4。心肌組織TNF-α免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：相較于生理鹽水組，順鉑組小鼠心肌組織TNF-α表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；相較于順鉑組，SCP+順鉑組小鼠心肌組織TNF-α表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2。相較于生理鹽水組，順鉑組小鼠心肌組織p-NF-κB表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；相較于順鉑組，順鉑+SCP組小鼠心肌組織p-NF-κB表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

表4 3組小鼠炎癥因子mRNA表達(dá)水平比較

A：心肌組織TNF-α免疫組織化學(xué)染色(×400)；B：TNF-α陽(yáng)性表達(dá)柱狀圖；a：P<0.001，與生理鹽水組比較；b：P<0.05，與順鉑組比較。

A：心肌組織NF-κB及其磷酸化水平檢測(cè)電泳圖；B：心肌組織p-NF-κB表達(dá)水平柱狀圖；a：P<0.001，與生理鹽水組比較；b：P<0.01，與順鉑組比較。

3 討 論

順鉑被發(fā)現(xiàn)可用于癌癥化療是源于20世紀(jì)時(shí)鉑網(wǎng)狀電解產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌細(xì)胞分裂的抑制。而后順鉑在臨床中被證明可對(duì)抗多種實(shí)體瘤，包括肉瘤、軟組織癌、骨骼癌、肌肉癌和血管癌等[1]。但是，順鉑引起的器官組織毒性是順鉑治療腫瘤的巨大障礙。癌癥化療藥物引起的心血管并發(fā)癥已成為癌癥治療中的常見(jiàn)問(wèn)題。大量臨床病例報(bào)道指出了順鉑在臨床應(yīng)用中出現(xiàn)的心臟事件，包括心律失常、心肌炎、心肌病和充血性心力衰竭[2-4，13-15]。研究表明，順鉑可使血漿肌鈣蛋白I(TPI)、肌酸激酶(CK)和CK-MB水平升高，這可能是順鉑誘導(dǎo)心臟功能障礙的主要原因[16]。同時(shí)，順鉑還引起心肌纖維紊亂和心肌細(xì)胞空泡細(xì)胞質(zhì)形成等毒理性組織學(xué)改變[1]。因此，尋找治療順鉑引起的心臟毒性并揭示順鉑毒性作用的機(jī)制具有重要意義。

五味子作為傳統(tǒng)中藥，臨床被應(yīng)用于保肝治療。它的多種天然提取物，如五味子乙素和五味子丙素，均被報(bào)道具有抗腫瘤、抗炎和抗氧化活性等藥理作用[5-6]。近年來(lái)，五味子及其活性成分在心血管疾病中的保護(hù)作用被逐漸發(fā)掘，不僅可以緩解去甲腎上腺素引起的心肌肥大與心力衰竭，還可以緩解由脂多糖或阿霉素引起的心肌細(xì)胞損傷[17-19]。在本研究中，小鼠經(jīng)順鉑處理后觀察到心功能(EF和FS)明顯降低，且LDH與CK-MB水平均明顯升高；不僅如此，經(jīng)順鉑處理后小鼠心肌纖維紊亂，與既往研究報(bào)道一致[9-10]。SCP治療后，小鼠心功能和心臟損傷均有所緩解。以上表明SCP具有抗順鉑誘導(dǎo)的心臟毒性作用。

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，促炎因子的釋放可導(dǎo)致細(xì)胞焦亡[20]。炎癥小體通過(guò)識(shí)別細(xì)胞外感染源，促進(jìn)炎癥因子調(diào)控蛋白的轉(zhuǎn)錄合成，而后釋放成熟的細(xì)胞因子引起炎癥反應(yīng)[21-22]。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道炎癥反應(yīng)可驅(qū)動(dòng)心肌肥大和心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射順鉑7 d后小鼠心臟組織NF-κB磷酸化水平升高，且IL-6、TNF-α、HMGB1和IL-1β的mRNA表達(dá)水平亦明顯升高(P<0.05)。經(jīng)過(guò)SCP處理后，上述指標(biāo)均明顯降低(P<0.05)。這表明SCP對(duì)順鉑引起的心肌炎癥有著緩解作用，并且提示SCP緩解順鉑誘導(dǎo)的心臟毒性可能與其抑制心肌炎癥反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SCP能有效抑制順鉑誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維紊亂、心功能降低及心肌炎癥反應(yīng)，SCP可能作為治療順鉑誘導(dǎo)心臟毒性的候選藥物，并且靶向抑制炎癥反應(yīng)對(duì)抗順鉑誘導(dǎo)的心臟毒性是一種可行的治療策略。但本研究尚未深入探討SCP抗順鉑心臟毒性的分子機(jī)制及抗炎活性的作用靶點(diǎn)，尚待進(jìn)一步研究。