田婭媛，張文川，王寒明，王歡，馬富凱

面神經(jīng)炎癥反應(yīng)，創(chuàng)傷，腫瘤或手術(shù)操作均可能引起周?chē)悦嫔窠?jīng)麻痹，周?chē)悦嫔窠?jīng)麻痹常常引起患者功能缺失，造成患者審美、心理方面的問(wèn)題[1-4]。通常情況下，將神經(jīng)斷端直接縫合重建神經(jīng)連接是治療面神經(jīng)損傷的最佳方法，當(dāng)神經(jīng)斷端較長(zhǎng)時(shí)，無(wú)法將神經(jīng)斷端直接縫合。目前，自體神經(jīng)移植被認(rèn)為是連接神經(jīng)斷端的金標(biāo)準(zhǔn)方法，因?yàn)樗醒┩霞?xì)胞和基板，能有效促進(jìn)神經(jīng)再生。然而，自體神經(jīng)移植來(lái)源有限，因此需要尋找新的替代自體神經(jīng)移植的治療策略[5-6]。

前期的研究顯示，使用膠原管連接神經(jīng)斷端，修復(fù)神經(jīng)損傷時(shí)生物兼容性較好。膠原管惰性強(qiáng)，植入體內(nèi)后不易引起慢性炎癥反應(yīng)形成疤痕[7-8]，因此本研究使用膠原管橋接神經(jīng)斷端。研究顯示,肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、感覺(jué)神經(jīng)元有營(yíng)養(yǎng)支持作用[9]。本研究前期使用Traut’s和Sulfo-SMCC，通過(guò)兩步化學(xué)交聯(lián)成功將膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)交聯(lián)到膠原材料上[10]。該化學(xué)交聯(lián)方式不影響GDNF的生物學(xué)活性且GDNF的釋放速度得到了有效地控制。為防止HGF從損傷局部大量擴(kuò)散，本研究探索采用前期工作中的化學(xué)交聯(lián)法，將HGF通過(guò)化學(xué)交聯(lián)中構(gòu)建神經(jīng)導(dǎo)管連接神經(jīng)斷端，觀察該方法對(duì)損傷的面神經(jīng)的修復(fù)作用, 旨在為面神經(jīng)損傷的治療提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及膠原管 HGF購(gòu)自(Peprotech,Rocky Hill,NJ,USA)。膠原管購(gòu)自(Renerve,NIPRO,Osaka,Japan)。Traut’s和Sulfo-SMCC購(gòu)自(Thermo scientific)。雄性SD大鼠購(gòu)自斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 面神經(jīng)損傷模型制備及動(dòng)物分組 本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循科技部2006年9月發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。將1 cm長(zhǎng)的膠原管與Traut’s試劑反應(yīng)0.5 h，Sulfo-SMCC試劑與HGF反應(yīng)0.5 h。隨后將膠原管置于Sulfo-SMCC試劑與HGF反應(yīng)液中0.5 h，通過(guò)化學(xué)交聯(lián)將HGF錨定在膠原導(dǎo)管內(nèi)。雄性SD大鼠12只, 體質(zhì)量180～200 g, 隨機(jī)將動(dòng)物分為HGF組(實(shí)驗(yàn)組)和磷酸緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)組(對(duì)照組)，每組6只。大鼠經(jīng)4%戊巴比妥納(30 mg/kg) 腹腔麻醉后，在其左側(cè)面部切開(kāi)皮膚，暴露面神經(jīng)頰支，仔細(xì)分離神經(jīng)及周?chē)M織，使用手術(shù)剪剪去8 mm長(zhǎng)面神經(jīng)頰支，由于神經(jīng)收縮，造成1 cm長(zhǎng)神經(jīng)缺損，用膠原管連接神經(jīng)斷端，逐層縫合肌肉、皮膚。在HGF組，2 μg HGF錨定在膠原導(dǎo)管內(nèi)構(gòu)建神經(jīng)導(dǎo)管，對(duì)照組膠原管中填充PBS。

1.3 行為學(xué)觀察 正常情況下大鼠觸須向前豎起，并有節(jié)律拂動(dòng)。面神經(jīng)損傷后，觸須即向尾側(cè)垂下，且失去拂動(dòng)能力。術(shù)后8周，使用運(yùn)動(dòng)評(píng)分分析大鼠的功能恢復(fù)情況。評(píng)分規(guī)則如下[11]，0分：觸須無(wú)運(yùn)動(dòng)；1分：觸須有微量可觀測(cè)到的運(yùn)動(dòng)；2分：觸須有少量運(yùn)動(dòng)；3分：觸須不對(duì)稱(chēng)運(yùn)動(dòng)；4分：觸須對(duì)稱(chēng)運(yùn)動(dòng)。

1.4 電生理監(jiān)測(cè) 術(shù)后8周，將各組大鼠經(jīng)腹腔麻醉后，使用電生理儀檢測(cè)再生神經(jīng)傳導(dǎo)速度。將刺激電極置于面神經(jīng)近端，接收電極置于面神經(jīng)遠(yuǎn)端，檢測(cè)再生神經(jīng)的傳導(dǎo)速度。刺激強(qiáng)度為5 V，波寬為0.2 ms，頻率1 Hz。實(shí)驗(yàn)操作在室溫下進(jìn)行。

1.5 免疫組化 術(shù)后8周，將大鼠通過(guò)心臟灌注處死。仔細(xì)分離、暴露再生的面神經(jīng)，將新生神經(jīng)使用4%多聚甲醛固定2 d。隨后將新生神經(jīng)包埋于石蠟中行切片。經(jīng)脫水、抗原修復(fù)后，使用3%牛血清白蛋白在室溫下將切片封閉40 min。加入抗神經(jīng)絲蛋白200一抗，將切片放于濕盒內(nèi)再放入4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。使用PBS將切片洗滌3次，加入山羊抗鼠IgG二抗，再次使用PBS將切片洗滌3次，加入適量新鮮配置的DAB溶液，放入濕盒內(nèi)37 ℃孵育；最后使用Harris蘇木素中染色5 min左右，在倒置熒光顯微鏡下采集圖像；陽(yáng)性染色為棕黃色，細(xì)胞核染色為藍(lán)色。

1.6 透射電鏡觀察 術(shù)后8周，經(jīng)心臟灌注將大鼠處死，切取左側(cè)面神經(jīng)，將新生神經(jīng)迅速投入電鏡固定液4 ℃固定2～4 h。使用0.1 M PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次15 min。1%的鋨酸·0.1 M PBS(pH 7.4)室溫(20 ℃)固定2 h。0.1 M PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次15 min。組織依次置入50%～70%～80%～90%～95%～100%～100%酒精上行脫水，每次15 min。丙酮∶812包埋劑=1∶1混合液滲透過(guò)夜，純812包埋劑滲透過(guò)夜。60 ℃聚合48 h。切片機(jī)切片60～80 nm超薄切片。鈾鉛雙染色(2%醋酸鈾飽和水溶液，枸櫞酸鉛，各染色15 min)，切片室溫干燥過(guò)夜。透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

2 結(jié) 果

2.1 運(yùn)動(dòng)功能分析 各組大鼠面神經(jīng)損傷后，大鼠觸須即向尾側(cè)垂下, 失去拂動(dòng)能力, 口角歪向健側(cè)。術(shù)后各組大鼠觸須開(kāi)始拂動(dòng)，口角歪斜減輕，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，拂動(dòng)的幅度加大。HGF組大鼠恢復(fù)速度大于PBS組大鼠。至術(shù)后第8周時(shí)，HGF組大鼠功能評(píng)分顯著高于PBS組大鼠，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.2 電生理結(jié)果 術(shù)后第8周，對(duì)兩組大鼠進(jìn)行電生理測(cè)試，HGF組大鼠的神經(jīng)傳導(dǎo)速度顯著高于PBS組大鼠[(47.17±7.13)，(22.5±4.03)，P<0.01] 。見(jiàn)表1。

表1 神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)面神經(jīng)損傷的效果分析(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

2.3 透射電鏡觀察 術(shù)后第8周，透射電鏡結(jié)果顯示，HGF組有髓鞘神經(jīng)纖維直徑顯著大于PBS組，纖維分布較均勻，排列較為規(guī)則，纖維間有毛細(xì)血管和結(jié)締組織，部分纖維呈束狀生長(zhǎng)。HGF組髓鞘厚度亦顯著大于PBS組，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖1、表1。

圖1 電鏡下大鼠各組面神經(jīng)損傷后再生面神經(jīng)髓鞘形態(tài)

2.4 免疫組化 術(shù)后第8周，使用一抗對(duì)神經(jīng)纖維進(jìn)行染色，觀察HGF組和PBS組面神經(jīng)的再生情況。結(jié)果顯示單位面積下，神經(jīng)纖維陽(yáng)性面積在HGF組顯著高于PBS組。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2、表1。

陽(yáng)性染色為棕黃色(免疫組化染色，×40)

3 討 論

周?chē)窠?jīng)再生是再生醫(yī)學(xué)中的研究熱點(diǎn)[12-14]。迄今，面神經(jīng)損傷后神經(jīng)功能修復(fù)仍然沒(méi)有取得滿意的效果。神經(jīng)橫斷缺損較長(zhǎng)，無(wú)法通過(guò)直接縫合重建神經(jīng)連接時(shí)需要導(dǎo)管連接，引導(dǎo)神經(jīng)從近端向遠(yuǎn)端生長(zhǎng)[15-16]。在面神經(jīng)再生的眾多研究中，很少有解決神經(jīng)散亂生長(zhǎng)和臨床聯(lián)帶運(yùn)動(dòng)這樣的問(wèn)題[17]。前期的研究顯示，一些生長(zhǎng)因子能夠促進(jìn)神經(jīng)損傷后的再生[18-19]。HGF是一種有效的營(yíng)養(yǎng)因子，最初在干細(xì)胞的原代培養(yǎng)中被用作絲裂原而被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用[20]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，HGF還參與其他生理活動(dòng)，如器官再生、血管發(fā)生、腫瘤浸潤(rùn)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育等[21]。有研究顯示，周?chē)窠?jīng)損傷后HGF受體升高，然而內(nèi)源性HGF不足以促進(jìn)神經(jīng)損傷，外源性HGF在神經(jīng)損傷修復(fù)的早期階段起著重要作用[22]。

本研究將HGF通過(guò)化學(xué)交聯(lián)錨定于膠原導(dǎo)管內(nèi)構(gòu)建神經(jīng)導(dǎo)管用于連接神經(jīng)斷端，術(shù)后8周發(fā)現(xiàn)神經(jīng)導(dǎo)管能橋接神經(jīng)斷端，引導(dǎo)神經(jīng)叢近端向遠(yuǎn)端生長(zhǎng)，到達(dá)靶器官，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。以膠原導(dǎo)管為載體，將HGF錨定于膠原導(dǎo)管中能防止HGF隨體液流動(dòng)而大量擴(kuò)散，使得HGF在損傷局部維持有效的濃度，該神經(jīng)導(dǎo)管能有效促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)；本研究同時(shí)進(jìn)行了功能和形態(tài)學(xué)的分析。術(shù)后8周，形態(tài)學(xué)方面，透射電鏡和免疫組化結(jié)果顯示，有髓神經(jīng)纖維的數(shù)量和髓鞘厚度在HGF組顯著高于PBS組。功能學(xué)方面，觸須運(yùn)動(dòng)評(píng)分和電生理結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)評(píng)分和神經(jīng)傳導(dǎo)速度在HGF組顯著高于PBS組，功能學(xué)結(jié)果與形態(tài)學(xué)結(jié)果相似。本研究使用膠原導(dǎo)管作為HGF的載體，通過(guò)化學(xué)交聯(lián)防止HGF溶液在體液中大量擴(kuò)散。研究結(jié)果提示，將HGF通過(guò)化學(xué)交聯(lián)錨定于膠原導(dǎo)管構(gòu)建神經(jīng)導(dǎo)管能有效促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。