東金花， 吳葆華， 閆丹措

(青海省人民醫(yī)院消化科， 青海 西寧 810000)

結(jié)腸癌是最常見(jiàn)的癌癥死亡原因之一，盡管結(jié)腸鏡檢查以及結(jié)腸切除術(shù)、化學(xué)療法和免疫療法等診治方法不斷改進(jìn)，但仍有50%結(jié)腸癌患者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，5年生存率較低[1]。深入了解結(jié)腸癌進(jìn)展機(jī)制有助于尋找有效結(jié)腸癌治療方法。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類(lèi)環(huán)狀共價(jià)閉合的非編碼RNA，目前的研究認(rèn)為circRNA可作為微小RNA(miRNA)海綿抑制miRNA表達(dá)水平和功能作用，并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮調(diào)控作用[2]。circ_0011385在甲狀腺癌中表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)負(fù)調(diào)控miR-361-3p表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞惡性遷移和侵襲能力，抑制細(xì)胞凋亡和周期進(jìn)程[3]。circ_0011385在結(jié)腸癌進(jìn)展的研究仍不清楚。miR-330-3p是一種結(jié)直腸癌抑癌miRNA，miR-330-3p靶向BTB-CNC異體同源體1(BACH1)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力[4]。敲低人類(lèi)白細(xì)胞抗原F反義RNA1(HLA-F-AS1)可上調(diào)miR-330-3p進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[5]。生物信息學(xué)顯示miR-330-3p是circ_0011385的潛在靶點(diǎn)，但circ_0011385是否靶向miR-330-3p調(diào)控結(jié)腸癌進(jìn)展未見(jiàn)報(bào)道。本研究分析了circ_0011385和miR-330-3p在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況，分析二者表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系，并探討circ_0011385靶向miR-330-3p對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞惡性行為的影響，旨在為臨床防治結(jié)腸癌提供潛在策略。

1 材料與方法

1.1組織來(lái)源:選取2018年3月至2020年3月在我院確診且接受手術(shù)治療的80例結(jié)腸癌患者的癌組織和癌旁組織標(biāo)本，所有樣品立體后置于液氮中冷凍，后續(xù)保存在-80℃冰箱中。所有參與者術(shù)前均未接受放化療，且都簽署書(shū)面知情同意書(shū)，該研究得到了我院倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)。患者的臨床特征見(jiàn)表1。

表1 circ_0011385和miR-330-3p的表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系分析

1.2細(xì)胞和試劑:SW1116細(xì)胞購(gòu)自上海信裕生物工程公司；胎牛血清(FBS)、青鏈霉素雙抗(P/S)、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；TRIzol試劑購(gòu)自北京百奧萊博生物公司；SYBR Premix Ex Taq試劑盒、PrimeScript RT試劑盒購(gòu)自大連Takara公司；TaqMan miRNA試劑盒購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司；Transwell小室、Annexin V/PI檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；熒光素酶重組載體、si-circ_0011385、si-NC、anti-miR-330-3p、anti-miR-NC購(gòu)自廣州銳博生物。

1.3方 法

1.3.1RT-qPCR檢測(cè)circ_0011385和miR-330-3p表達(dá):TRIzol試劑從80對(duì)組織樣本提取總RNA后，用PrimeScript RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用SYBR Premix Ex Taq試劑盒檢測(cè)circ_0011385表達(dá)。采用TaqMan miRNA試劑盒檢測(cè)miR-330-3p表達(dá)。GAPDH和U6分別作為circ_0011385、miR-330-3p的內(nèi)參，用2-ΔΔCt方法計(jì)算circ_0011385、miR-330-3p的相對(duì)表達(dá)量。miR-330-3p引物序列5'-GCAGAGATTCCGTTGTCGT-3'(上游)，5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3'(下游)；U6引物序列5'-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3'(上游)，5'-GTACAACACATTGTTTCCTCGGA-3'(下游)；circ_0011385引物序列5′-TGACAACAATGAGCCCTACA-3′(上游)，5′-TTTCCTTGGCACTATACTGG-3′(下游)；GAPDH引物序列5′-TGT TCG TCA TGG GTG TGAAC-3′(上游)，5′-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′(下游)。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)和分組:SW1116細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，條件為37℃、95%、CO25%。細(xì)胞長(zhǎng)至80～90%融合度時(shí)加入5mL胰蛋白酶消化3min，1∶3傳代。將對(duì)數(shù)期SW1116細(xì)胞按2×104個(gè)/孔接種24孔板，用lipofectamine 2000將si-NC、si-circ_0011385、si-circ_0011385+anti-miR-NC、si-circ_0011385+anti-miR-330-3p分別轉(zhuǎn)染50%融合度的細(xì)胞，共分為si-NC組、si-circ_0011385組、si-circ_0011385+anti-miR-NC組、si-circ_0011385+anti-miR-330-3p組。培養(yǎng)48h收集細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)circ_0011385或者miR-330-3p表達(dá)水平。

1.3.3雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn):circular RNA interactome數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到circ_0011385與miR-330-3p存在結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)miR-330-3p的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)擴(kuò)增circ_0011385的野生型(WT)或突變型(MUT)序列并克隆到pmirGLO載體中，構(gòu)建重組載體WT-circ_0011385、MUT-circ_0011385。將重組載體與miR-330-3p mimics或miR-NC共轉(zhuǎn)染SW1116細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性。

1.3.4Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SW1116細(xì)胞遷移和侵襲:侵襲檢測(cè)選用包被基質(zhì)膠的Transwell小室，遷移檢測(cè)選用未包被基質(zhì)膠的Transwell小室。將5×104個(gè)轉(zhuǎn)染48h SW1116細(xì)胞重懸在200 μL無(wú)血清培養(yǎng)液并接種于Transwell上腔室，24孔板下腔室加入500 μL完全培養(yǎng)液。將24孔培養(yǎng)板置于37℃溫箱中培養(yǎng)24h。用4%多聚甲醛固定穿膜細(xì)胞，雙蒸水沖洗3次，干燥后用0.5%結(jié)晶紫染色。顯微鏡下觀察細(xì)胞侵襲或遷移情況。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SW1116細(xì)胞凋亡:胰酶消化轉(zhuǎn)染48h細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌兩次，1×結(jié)合緩沖液重懸后，用Annexin V/PI檢測(cè)試劑盒染色。流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞。

2 結(jié) 果

2.1circ_0011385和miR-330-3p在結(jié)腸癌組織中的表達(dá):結(jié)腸癌組織與癌旁組織比較circ_0011385表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，miR-330-3p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1A和1B。結(jié)腸癌組織中circ_0011385和miR-330-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.8924)，見(jiàn)圖1C。

2.2circ_0011385和miR-330-3p的表達(dá)與患者臨床指標(biāo)的關(guān)系:circ_0011385和miR-330-3p的表達(dá)與結(jié)腸癌患者的年齡、腫瘤大小無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，但與分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表1。

圖1 結(jié)腸癌組織中circ_0011385和miR-330-3p的表達(dá)及相關(guān)性分析

2.3circ_0011385靶向調(diào)控miR-330-3p:circular RNA interactome在線分析顯示circ_0011385和miR-330-3p存在互補(bǔ)序列，見(jiàn)圖2A。共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circ_0011385和miR-330-3p mimics組SW1116細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性顯著低于共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circ_0011385和miR-NC組(P<0.05)，見(jiàn)圖2B。與si-NC組比較，si-circ_0011385組SW1116細(xì)胞circ_0011385表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，而miR-330-3p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2C-D。

圖2 circ_0011385靶向調(diào)控miR-330-3p

2.4circ_0011385和miR-330-3p對(duì)SW1116遷移、侵襲的影響:與si-NC組比較，si-circ_0011385組SW1116細(xì)胞遷移數(shù)、遷移數(shù)顯著減少(P<0.05)；與si-circ_0011385+anti-miR-NC組比較，si-circ_0011385+anti-miR-330-3p組SW1116細(xì)胞遷移數(shù)、遷移數(shù)顯著增多(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 circ_0011385和miR-330-3p對(duì)SW1116遷移、侵襲的檢測(cè)

2.5circ_0011385和miR-330-3p對(duì)SW1116凋亡的影響:與si-NC組比較，si-circ_0011385組SW1116細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與si-circ_0011385+anti-miR-NC組比較，si-circ_0011385+anti-miR-330-3p組SW1116細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 circ_0011385和miR-330-3p對(duì)SW1116凋亡的檢測(cè)

3 討 論

多項(xiàng)研究揭示了circRNA和miRNA表達(dá)失調(diào)在結(jié)腸癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用。Zhou等[6]研究證實(shí)circ_100859表達(dá)水平與TNM分期、組織學(xué)分級(jí)相關(guān)，對(duì)結(jié)腸癌患者具有較高的診斷和預(yù)后價(jià)值，circ_100859靶向miR-219促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡。He等[7]發(fā)現(xiàn)circRNA-ACAP2通過(guò)調(diào)控hsa-miR-21-5p/Tiam1軸促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞惡性行為。本研究檢測(cè)到circ_0011385在結(jié)腸癌組織中表達(dá)增加，而miR-330-3p表達(dá)減少，且circ_0011385和miR-330-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。進(jìn)一步分析顯示，circ_0011385和miR-330-3p的表達(dá)與結(jié)腸癌患者的年齡、腫瘤大小無(wú)相關(guān)性，但與分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，這提示circ_0011385和miR-330-3p差異表達(dá)參與結(jié)腸癌進(jìn)展。近年研究表明部分circRNA具有特定miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，circRNA可吸附miRNA進(jìn)而間接調(diào)控miRNA對(duì)靶mRNA表達(dá)的影響[8]，如circ_000166通過(guò)下調(diào)miR-330-5p、上調(diào)Ets樣蛋白1(ELK1)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲[9]。本研究證實(shí)miR-330-3p是circ_0011385的直接靶點(diǎn)，這提示circ_0011385可能靶向miR-330-3p調(diào)控結(jié)腸癌進(jìn)展。

研究報(bào)道circ_0011385靶向miR-149-5p參與促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。為探討circ_0011385在結(jié)腸癌中的功能，本研究結(jié)果顯示，沉默circ_0011385表達(dá)顯著降低SW1116細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)，增加細(xì)胞凋亡率，這表明沉默circ_0011385可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲行為并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，circ_0011385在結(jié)腸癌中起到致癌的作用。miRNA可以調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展中多個(gè)基因的表達(dá)，并參與調(diào)控細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等重要生物學(xué)過(guò)程[10]。miR-330-3p在不同腫瘤中差異表達(dá)，肝癌組織中miR-330-3p低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-330-3p可通過(guò)靶向絲裂原活化蛋白激酶激酶1(MAP2K1)抑制腫瘤進(jìn)展[11]。LINC01094通過(guò)下調(diào)miR-330-3p促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[12]。在前列腺癌和三陰性乳腺癌中miR-330-3p還是circ_0016068的靶miRNA，沉默circ_0016068通過(guò)上調(diào)miR-330-3p表達(dá)來(lái)抑制腫瘤進(jìn)展[13]。本研究發(fā)現(xiàn)沉默circ_0011385可促進(jìn)miR-330-3p表達(dá)，且沉默circ_0011385與既往研究報(bào)道過(guò)表達(dá)miR-330-3p的抗結(jié)直腸癌作用一致[4,5]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，抑制miR-330-3p表達(dá)減弱沉默circ_0011385對(duì)SW1116細(xì)胞凋亡、遷移侵襲的作用，這表明circ_0011385通過(guò)靶向miR-330-3p調(diào)控結(jié)腸癌進(jìn)展。

總之，結(jié)腸癌中circ_0011385表達(dá)上調(diào)，沉默circ_0011385通過(guò)上調(diào)miR-330-3p表達(dá)可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，并抑制遷移和侵襲。因此，circ_0011385和miR-330-3p可能是結(jié)腸癌治療的潛在靶點(diǎn)。