夏麗瓊， 楊明華， 謝 燕

(四川省綿陽市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科， 四川 綿陽 621000)

腦膠質(zhì)瘤為臨床常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，常發(fā)生于神經(jīng)外胚層，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的40%左右[1]。由于腦膠質(zhì)瘤生長迅速、侵襲性強、浸潤能力強，患者的生存率較低，行手術(shù)切除輔助放化療進行治療無法避免手術(shù)創(chuàng)傷大、易復(fù)發(fā)、預(yù)后不良等問題[2]。近年來，免疫療法在其他腫瘤治療中取得進展，抗腫瘤特異性強，不良反應(yīng)輕微，有望成為手術(shù)后的最佳輔助治療方法。γδT細(xì)胞是具有特異性抗腫瘤活性的固有免疫T細(xì)胞，已應(yīng)用于腫瘤的過繼性細(xì)胞免疫治療[3]。Zeste基因增強子人類同源物2(enhancer of Zeste homolog 2，EZH2)是一種甲基化酶，可通過甲基化修飾抑制抑癌基因的表達，進而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖[4]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子4(signal transducer and activator of transcription 4，STAT4)通路是重要的細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，磷酸化后可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-γ(interferon gamma，IFN-γ)，在腫瘤細(xì)胞的免疫治療中發(fā)揮重要作用[5]。GSK343是一種EZH2抑制劑，有研究顯示，GSK343在癌癥治療領(lǐng)域具有良好的前景及臨床價值[6]，但對腦膠質(zhì)瘤及腫瘤免疫的作用鮮有研究。本研究將通過研究GSK343對腦膠質(zhì)瘤U373細(xì)胞EZH2/STAT4/IFN-γ通路及γδT細(xì)胞殺傷作用的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器：U373(人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系)(貨號：YS3679C)、胰蛋白酶(貨號：9002-07-7)，上海彩佑；DMEM培養(yǎng)液(貨號：ZY-P0032)，上海澤葉；胎牛血清(貨號：S9030)、EZH2抗體(貨號：Ezh2 Antibody)、p-STAT4抗體(貨號：bs-3430R-2)、IFN-γ抗體(貨號：BA3383-2)，上海恒斐；GSK343(貨號：S81294)，上海源葉；CCK-8試劑(貨號：QN1293-OIR)、AnnexinV-FITC/PI試劑盒(貨號：WE0325-THR)，北京百奧萊博；MODEL550酶標(biāo)儀及ChemiDocXRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad；BD FACSCanto II流式細(xì)胞儀，美國BD。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組：取出在液氮罐中凍存的人腦膠質(zhì)瘤U373細(xì)胞，37℃水浴復(fù)蘇，接種在DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，消化、傳代。U373細(xì)胞接種96孔培養(yǎng)板(1×105個/mL)，每孔100μL，設(shè)置分組為：對照組(細(xì)胞正常培養(yǎng)，不做藥物處理)和GSK343組(GSK343處理細(xì)胞)。

1.2.2CCK-8法檢測各組U373細(xì)胞增殖：將對照組、GSK343組(分別用10μmoL/L、20μmoL/L、50μmoL/L和100μmoL/L GSK343處理細(xì)胞[7])U373細(xì)胞培養(yǎng)48h，加10μL CCK-8，37℃培養(yǎng)4h，酶標(biāo)儀(450nm)測吸光度(optical density，OD)值，計算細(xì)胞增殖抑制率=(OD對照組-OD處理組)/OD對照組×100%[7]。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測U373細(xì)胞凋亡：U373細(xì)胞培養(yǎng)48h，收集、消化、洗滌并調(diào)整為1×106個/mL，分別加入Annexin V-FITC、PI各5μL，1h避光孵育，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率[7]。

1.2.4WB法檢測EZH2、p-STAT4、IFN-γ蛋白表達情況：將對照組、GSK343組U373細(xì)胞培養(yǎng)48h，收集、提取總蛋白、定量。電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)PDVF膜、5%脫脂奶粉封閉1h，分別加入一抗EZH2抗體(1∶500)、p-STAT4抗體(1∶500)、IFN-γ抗體(1∶500)、GAPDH抗體(1∶500)，4℃過夜孵育，加羊抗兔二抗(1∶5000)，常溫孵育1h，發(fā)光法顯色，拍攝圖像，分析條帶灰度，目的蛋白相對表達量為目的蛋白與內(nèi)參GAPDH的條帶灰度值比值[7]。

1.2.5顯微鏡觀察U373細(xì)胞形態(tài)：在對照組、GSK343組基礎(chǔ)上按10∶1的效靶比加入100μL γδT細(xì)胞(武漢普諾賽生命科技有限公司)，孵育24h后，倒置顯微鏡觀察U373細(xì)胞形態(tài)。

1.2.6CCK-8法檢測γδT細(xì)胞對U373細(xì)胞的殺傷作用：在對照組、GSK343組基礎(chǔ)上按10∶1的效靶比加入100μL γδT細(xì)胞，同時分別設(shè)立相應(yīng)的空白對照組、γδT細(xì)胞對照組和U373細(xì)胞對照組。孵育24h后，每孔加入CCK-8試劑20μL，繼續(xù)孵育4h后，在酶標(biāo)儀450nm處檢測每孔OD值，計算殺傷活性。殺傷活性(%)=[1-(實驗組OD值-γδT細(xì)胞對照組OD值)/(U373細(xì)胞對照組OD值-空白對照組OD值)]×100%[3]。

2 結(jié) 果

2.1GSK343對U373細(xì)胞增殖的影響：隨著GSK343的處理及處理濃度的升高，U373細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，U373細(xì)胞的GSK343半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentartion，IC50)處于20-50μmoL/L范圍內(nèi)，故選擇50μmoL/L作為GSK343組的最佳處理濃度進行后續(xù)實驗，見圖1。

圖1 各組U373細(xì)胞增殖抑制率

2.2GSK343對U373細(xì)胞凋亡的影響：與對照組相比，GSK343組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測GSK343對U373細(xì)胞凋亡的影響

2.3GSK343對U373細(xì)胞中EZH2、p-STAT4、IFN-γ蛋白表達的影響：GSK343組EZH2蛋白水平較對照組顯著降低(P<0.05)，p-STAT4、IFN-γ蛋白水平較對照組顯著升高(P<0.05)。見圖3。

圖3 WB檢測GSK343對U373細(xì)胞中EZH2、p-STAT4、IFN-γ蛋白表達的影響

2.4GSK343對γδT細(xì)胞殺傷的U373細(xì)胞形態(tài)的影響：與對照組相比，GSK343組有更多的U373細(xì)胞呈現(xiàn)不規(guī)則長梭形、胞質(zhì)腫脹的細(xì)胞形態(tài)，見圖4。

圖4 顯微鏡觀察GSK343對γδT細(xì)胞殺傷的U373細(xì)胞形態(tài)的影響

2.5GSK343對U373細(xì)胞中γδT細(xì)胞殺傷作用的影響：各個時間點，與對照組相比，GSK343組γδT細(xì)胞對U373細(xì)胞的殺傷活性均顯著升高(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組γδT細(xì)胞對U373細(xì)胞的殺傷活性

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見的腫瘤類型之一，起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其組織類型包括星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等。腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病率、惡性程度均較高，嚴(yán)重威脅人類生命。而目前外科手術(shù)切除等治療對腦膠質(zhì)瘤患者生存率的改善作用并不顯著。近年來，發(fā)現(xiàn)免疫治療在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用，正逐漸受到人們關(guān)注。γδT細(xì)胞是一群存在于外周血、具備天然免疫和適應(yīng)性免疫雙重功能、可用于腫瘤免疫細(xì)胞治療的T細(xì)胞亞群，其T細(xì)胞抗原受體(T cell receptor，TCR)由γ、δ鏈組成。但由于腫瘤細(xì)胞表面表達的為γδ細(xì)胞，其所識別的分子常常丟失，導(dǎo)致免疫逃逸發(fā)生，限制了γδT細(xì)胞免疫治療腫瘤的效果[8]。因此，進一步研究影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞有關(guān)通路及γδT細(xì)胞殺傷作用的新靶點，可為腦膠質(zhì)瘤防治提供參考。

EZH2是表觀遺傳調(diào)控基因，能夠?qū)M蛋白H3第27位賴氨酸三甲基催化從而抑制靶基因的表達。Ma等[9]研究表明，EZH2抑制劑可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并有效降低其遷移能力。Yi等[10]研究表明，EZH2在卵巢癌中呈上調(diào)表達，通過介導(dǎo)TIMP2表觀遺傳沉默促進卵巢癌的遷移和侵襲能力，且使用EZH2抑制劑抑制EZH2表達可激活TIMP2轉(zhuǎn)錄進而影響卵巢癌的遷移、侵襲過程。丁沐陽等[11]研究表明，EZH2抑制劑GSK343對宮頸癌細(xì)胞的增殖與遷移能力具有明顯抑制作用。本研究結(jié)果顯示，隨著GSK343的處理及處理濃度的升高，U373細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，提示GSK343可呈濃度依賴性抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U373的增殖過程，并根據(jù)IC50將50μmoL/L GSK343作為處理U373細(xì)胞的最適濃度，并用于后續(xù)實驗中。后續(xù)實驗結(jié)果顯示，使用GSK343后，U373細(xì)胞OD值顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，細(xì)胞中EZH2蛋白表達水平顯著降低，提示GSK343可抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中EZH2蛋白表達，抑制細(xì)胞增殖，并促進其凋亡，具有很好的腫瘤抑制作用，但具體作用途徑尚需進一步研究。

免疫是消滅腫瘤細(xì)胞的重要調(diào)控方式，涉及多種免疫細(xì)胞及復(fù)雜的通路調(diào)控。STAT蛋白家族是由多個相同結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的胞內(nèi)蛋白質(zhì)家族，激活后參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在細(xì)胞發(fā)育、增殖和免疫防御中起重要作用[12]。STAT4是STAT蛋白家族成員之一，在子宮內(nèi)膜癌組織中表達升高，并與患者的病理分期、腫瘤分化、肌層浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及3年預(yù)后生存有關(guān)。沈娟等[13]研究表明，IL-12通過促進STAT-4的磷酸化恢復(fù)自然殺傷細(xì)胞細(xì)胞的免疫功能。IFN-γ是目前Ⅱ型干擾素家族中發(fā)現(xiàn)的唯一成員，由T細(xì)胞產(chǎn)生，具有直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抗腫瘤血管、增加腫瘤表面主要組織相容性復(fù)合體抗原和腫瘤壞死因子表達生成等多種抗腫瘤作用。IFN-γ可增強原發(fā)性、復(fù)發(fā)性和肺轉(zhuǎn)移骨肉瘤患者γδT細(xì)胞對骨肉瘤細(xì)胞的殺傷作用。本研究顯示，使用GSK343后，U373細(xì)胞中STAT4蛋白磷酸化、IFN-γ蛋白表達水平顯著升高，提示GSK343抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中EZH2蛋白表達后，可進一步促進STAT4磷酸化及IFN-γ蛋白表達，影響細(xì)胞增殖與凋亡。

近年來，γδT細(xì)胞在抗腫瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞中研究較多，體外擴增γδT細(xì)胞在腫瘤的臨床治療中療效較好。但腫瘤細(xì)胞為γδT細(xì)胞識別的表面分子丟失易造成免疫逃逸，發(fā)生免疫耐受，為了提高γδT細(xì)胞的臨床腫瘤治療療效，研究人員通過優(yōu)化治療方案，以期提高γδT細(xì)胞的殺傷活性。近年來研究顯示，GSK343在癌癥治療方面具有良好療效[14]，但其對腫瘤細(xì)胞中γδT細(xì)胞的殺傷作用的影響尚不完全明確。本研究結(jié)果顯示，使用GSK343后，U373細(xì)胞更易發(fā)生形態(tài)變化，各個時間點的γδT細(xì)胞對U373細(xì)胞的殺傷活性均顯著升高，提示GSK343有助于提高γδT細(xì)胞對U373細(xì)胞的殺傷活性，防止腫瘤免疫逃逸。趙珺等[15]研究顯示，托法替尼可通過抑制抗原刺激后人γδT細(xì)胞的活化及STAT4磷酸化、IFN-γ產(chǎn)生，從而抑制γδT細(xì)胞功能，治療自身免疫性疾病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。故推測GSK343可能通過調(diào)控EZH2，影響STAT4/IFN-γ通路，進而增強γδT細(xì)胞對U373細(xì)胞的殺傷作用，但具體作用機制還有待深入探究。

綜上所述，GSK343可通過下調(diào)EZH2表達及上調(diào)STAT4蛋白磷酸化、IFN-γ蛋白表達從而提高γδT細(xì)胞對腦膠質(zhì)瘤U373細(xì)胞的殺傷作用，導(dǎo)致U373細(xì)胞增殖受到抑制，并誘導(dǎo)其凋亡，其對γδT細(xì)胞殺傷作用的提高可能有助于提高臨床免疫治療療效。但本研究為細(xì)胞體外培養(yǎng)實驗，在體內(nèi)的效果還需進一步驗證，GSK343影響U373細(xì)胞EZH2/STAT4/IFN-γ通路與影響γδT細(xì)胞殺傷作用的內(nèi)在聯(lián)系還需深入研究。