馬 力，宋延平，楊彥平，趙林濤，郭 倩

(1. 陜西中醫(yī)藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中醫(yī)藥研究院，西安 7100033;西安雨田農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，西安 710065)

仔豬細菌性腹瀉是由于感染大腸桿菌等細菌以及飼養(yǎng)管理不當造成的一種高發(fā)的腸道疾病，好發(fā)于10～30日齡仔豬，致死率高[1]。中獸醫(yī)認為仔豬細菌性腹瀉多因機體正氣不足，寒濕暑熱等外邪趁機入侵、飲食不潔、飼養(yǎng)過飽等，導致脾胃腐熟、運化失調(diào)、清濁不分,毒邪滯留腸中,使腸道氣滯血瘀,化為膿血,故下痢色白或帶膿血；嚴重者會導致中氣下陷,出現(xiàn)脫肛等現(xiàn)象,嚴重者亡陽虛脫致死；中醫(yī)治則多采用澀腸止瀉、清熱燥濕的方劑治療該病,必要時以扶正固本的中藥為輔[2]。已有文獻報道，應用我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療細菌性仔豬腹瀉有良好的效果[3-5]。

苦白石顆粒由苦參、白頭翁、石榴皮、仙鶴草、肉桂、木香等中藥制成,方中苦參、白頭翁清熱燥濕、涼血止痢[6,7]；仙鶴草、石榴皮可收斂止血止痢、澀腸止瀉[8,9];肉桂[10]補元陽、暖脾胃,治命門火衰、亡陽虛脫、腹痛泄瀉;木香[11]主治行氣止痛、健脾消食,諸藥合用,具有清熱燥濕、澀腸止瀉、扶陽固本、健胃消食的作用,可治療仔豬濕熱下痢,且臨床試驗表明療效可靠,安全性實驗結(jié)果顯示對仔豬無毒副作用,是臨床值得推廣的中獸藥方劑[12-14]。但是目前苦白石顆粒作用于仔豬腹瀉的機制和通路研究較少，無法體現(xiàn)中藥通過多成分、多靶點、多通路共同作用的特點。

網(wǎng)絡藥理學以系統(tǒng)生物學為基礎，結(jié)合多向藥理學、分子網(wǎng)絡數(shù)據(jù)以及計算機模擬分析等技術(shù)，通過構(gòu)建藥物—成分—靶點之間的復雜網(wǎng)絡關(guān)系來闡明藥物作用的方法。在這項研究中，首先通過生物利用度和藥物相似度篩選獲得苦白石顆粒的有效成分，預測了活性成分的潛在靶點并進行了相應的基因本體(GO)分析和京都基因組百科全書(KEGG)富集分析，對方中的關(guān)鍵活性成分和靶點蛋白進行了分子對接。利用網(wǎng)絡藥理學結(jié)合分子對接技術(shù)對潛在活性成分作用于靶點和通路的機制進行初步研究，這符合中醫(yī)治療疾病的整體觀念，也為其深入研究和進一步新藥開發(fā)提供參考。

1 材料和方法

網(wǎng)絡藥理學和分子對接的具體研究內(nèi)容和方法見圖1。

圖1 研究內(nèi)容和方法流程圖Fig. 1 Flow chart of research contents and methods

1.1 篩選苦白石顆粒的活性成分 現(xiàn)代中藥化學已對苦白石顆粒中6味中藥進行了很多研究，發(fā)現(xiàn)其中含有的化合物，有些已被報道具有抑菌[8]、調(diào)節(jié)炎癥因子[6]等顯著的藥理活性。這對利用網(wǎng)絡藥理學的方法來研究藥物在中醫(yī)藥治理論指導下治療疾病提供了良好的思路。

所有候選化合物中肉桂的活性成分來自于BATMAN數(shù)據(jù)庫(Score cutoff≥20， Adjusted P-value≥0.05)，并錄入 TCMSP以匹配信息；其余5種中藥均來自于TCMSP數(shù)據(jù)庫(選擇DL≥0.18和OB≥30%為篩選條件[15])，以及相關(guān)文獻數(shù)據(jù)的整理。

1.2 藥物靶點預測 預測藥物靶點是解釋中藥進入體內(nèi)生物作用過程的基礎。TCSMP數(shù)據(jù)庫通過已獲取活性成分預測其潛在作用靶點。

1.3 仔豬細菌性腹瀉差異表達基因的篩選 芯片數(shù)據(jù)(GSE28003)[16]從GEO數(shù)據(jù)庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中下載，這個芯片數(shù)據(jù)是基于GPL3533 芯片平臺。GSE28003包含了18例樣品標本，其中12例經(jīng)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)GIS26菌株處理，6例作為正常對照，采用GEO2R在線工具篩選由于ETEC感染的腹瀉仔豬和正常仔豬樣本的差異表達基因(differential expression genes(DEGs),設置閾值為：|log2FC|>0.5，校正P<0.05。FC(fold change)代表兩組基因表達值間的差異倍數(shù)。

1.4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡構(gòu)建及核心靶點篩選 藥物預測靶點和疾病靶點映射后得到交集靶點，導入String(https:∥string-db.org/cgi/input.pl)將蛋白質(zhì)互作關(guān)系網(wǎng)絡數(shù)據(jù)保存為“.tsv”文件，通過Cytoscape3.7.2[17]進行可視化，并利用其內(nèi)置network analyzer 分析工具分析網(wǎng)絡特征參數(shù)，包括連接度中心性(Degree centrality，DC)、緊密度中心性(Closeness centrality，CC)、介度中心性(Betweenness centrality，BC)等。

1.5 構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖

構(gòu)建 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡主要通過軟件Cytoscape3.7.2來完成，其中節(jié)點代表藥物、活性成分、靶點或疾病，邊代表它們之間的相互關(guān)系；同時利用network analyzer計算各個節(jié)點的重要屬性值，以研究其中較為重要的成分和靶點之間的關(guān)系。

1.6 富集分析 基因本體論(GO)和《京都議定書》百科全書的基因和基因組(KEGG)分析獲得的生物過程和信號相關(guān)通路相關(guān)也是研究藥物作用于人體的關(guān)鍵。Metascape平臺(http:∥metascape.org)[18]可對靶點進行通路富集分析，該平臺更新及時，整合了GO、KEGG、Uniprot 等多個權(quán)威的功能數(shù)據(jù)庫，支持對批量基因或蛋白質(zhì)進行注釋、富集分析及構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡，GO富集分析可分為細胞成分(CC)、分子功能(MF)和生物過程(BP)三個部分。將潛在作用靶點導入Metascape 平臺進行GO 及KEGG 分析，保存其結(jié)果并對其進行可視化。

1.7 分子對接 從Protein Data Bank (PDB, http:∥www.rcsb.org)[19]下載關(guān)鍵蛋白結(jié)構(gòu)，從ZINC database (http:∥zinc.docking.org/)[20]中找到主要活性成組分的三維結(jié)構(gòu)。將改造后的蛋白和組分引入AutoDock Vina進行分子對接，在相同條件下進行分子對接模擬，兩者結(jié)合能越低，構(gòu)象越穩(wěn)定，發(fā)生作用可能性越大，一般以結(jié)合能絕對值大于 4.25 說明具有結(jié)合活性，大于 5.0 表明有較好的結(jié)合活性，大于 7.0 說明具有強烈的結(jié)合活性[15]；選擇構(gòu)象最高、結(jié)合自由能絕對值最大的對接結(jié)果,并應用 Pymol軟件將對接結(jié)果可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦白石顆粒的活性成分 在TCSMP數(shù)據(jù)庫中通過各組分的ADME性質(zhì)來篩選潛在的活性成分，結(jié)果得到了74個OB≥30%、DL≥0.18的潛在活性分子(苦參45個，白頭翁11個，石榴皮7個，仙鶴草5個，木香6個)；通過BATMAN數(shù)據(jù)庫(Score cutoff≥20， Adjusted P-value≥0.05)，共得到了肉桂19個活性成分。最后，共有93個化合物被認為是苦白石顆粒潛在的活性化合物。

2.2 獲取活性成分的潛在靶點 通過TCSMP數(shù)據(jù)庫對93種潛在活性化合物的靶點進行了預測，共收集到269個靶點。其中，苦參45種潛在有效成分共同作用于203個靶點; 白頭翁11種潛在有效成分共同作用于83個靶點; 石榴皮7種潛在有效成分共同作用于197個靶點; 仙鶴草5種潛在有效成分共同作用于182個靶點; 肉桂19種潛在有效成分共同作用于77個靶點;木香6種潛在活性成分共同作用于32個靶點。因此，不同的活性化合物可以作用于同一靶點，同一活性化合物也可以作用于不同的靶點，體現(xiàn)了中藥復方多組分、多靶點的作用特點。

2.3 苦白石顆粒治療仔豬細菌性腹瀉的靶點基因

GEO基因數(shù)據(jù)庫篩選仔豬細菌性腹瀉差異表達基因，再根據(jù)文獻報道補充未預測到的有效成分的已知靶點，并利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫將所得靶點標準化，共得到疾病靶點479個，其中上調(diào)基因270個，下調(diào)基因209個。與2.2獲取的潛在靶點相映射，得到苦白石顆粒治療仔豬細菌性腹瀉的靶點32個，如圖2。

圖2 交集靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagram of intersection target

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡的構(gòu)建與分析 將獲得的32個交集靶點基因?qū)?String 數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Sus scrofa”，將獲得的數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡圖(隱藏掉沒有交集的靶點)。結(jié)果顯示，該網(wǎng)絡共涉及 25個節(jié)點、106條邊，如圖3所示節(jié)點顏色越深，形狀越大，說明其在網(wǎng)絡中越重要。不難發(fā)現(xiàn)TNF、VEGFA IL6、IL8、ICAM-1、SERPINE1、MMP1、MMP3等靶點與其他靶點相互作用較強，藥物作用于機體時這些靶點發(fā)揮重要作用。

String的PPI圖 Cytoscape的PPI圖圖3 蛋白相互作用網(wǎng)絡圖Fig. 3 Protein-protein interaction network

2.5 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡構(gòu)建與分析 靶點與其對應的潛在活性成分導入Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建了苦白石顆粒治療仔豬細菌性腹瀉的“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖。其中綠色三角代表藥物，Piglet diarrhoea代表疾病，主要的活性成分用藍紫色的圓形表示，黃色的四邊形代表靶點(圖4)。對化學成分進行度值計算，發(fā)現(xiàn)度值較高的槲皮素、木犀草素、山奈酚等潛在活性成分可能是防控仔豬細菌性腹瀉的關(guān)鍵成分。

String的PPI圖 Cytoscape的PPI圖圖4 藥物-活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡圖Fig. 4 Drug - active ingredient - target - disease network

2.6 苦白石顆粒治療仔豬細菌性腹瀉通路富集結(jié)果分析及可視化

2.6.1 GO富集分析 對核心靶點分別進行GO-CC、GO-BP和GO-MF富集分析，并將基因結(jié)果進行可視化，如圖5。生物過程的富集結(jié)果主要集中在對脂多糖和氧含量的調(diào)節(jié)、損傷反應、細胞運動的正調(diào)節(jié)以及凋亡信號通路的負調(diào)控等。細胞組成主要包括參與膜筏組織的蛋白、細胞外基質(zhì)、粘著斑、線粒體被膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔以及分泌顆粒內(nèi)腔等，表明藥物的活性成分會與多種蛋白相結(jié)合而發(fā)揮治療疾病的作用。就分子功能而言，藥物治療仔豬細菌性腹瀉的作用主要與細胞因子的活性、血紅素的結(jié)合、蛋白酶結(jié)合以及與DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等分子功能相關(guān)，這些分子功能主要參與炎癥反應、蛋白質(zhì)和藥物的選擇性作用，從而影響機體的結(jié)構(gòu)和功能。

圖5 GO富集分析結(jié)果Fig. 5 GO enrichment analysis results

2.6.2 KEGG通路分析 將核心靶點進行KEGG通路富集分析，不難發(fā)現(xiàn)IL-17信號通路、HIF-1信號通路(排除與仔豬腹瀉無關(guān)的通路)等主要在炎癥反應、免疫調(diào)節(jié)以及細胞凋亡等方面發(fā)揮作用，這與GO富集結(jié)果具有一致性，說明苦白石顆粒主要活性成分的作用靶點是多條不同通路、多種成分、多個靶點相互作用的，如圖6。

圖6 KEGG富集分析結(jié)果Fig. 6 KEGG enrichment analysis results

2.7 對接結(jié)果 分子對接結(jié)果顯示，苦白石顆粒中DC值最高的3個化合物分別與治療核心靶點一一進行對接，這些關(guān)鍵成分與核心靶點蛋白的結(jié)合能普遍較高，如表3，這進一步表明AG可能通過多組分靶通路模式發(fā)揮治療仔豬細菌性腹瀉的作用，部分可視化結(jié)果如圖7。

Luteolin—TNF Quercetin—TNF Kaempferol—TNFLuteolin—IL6 Quercetin—MMP1 Luteolin—ICAM-1圖7 分子對接可視化結(jié)果Fig. 7 Visualization results of molecular docking

表1 3個化合物與核心靶點分子對接結(jié)果Table 1 Docking results of three compounds with core target molecules

3 討論與結(jié)論

武超[21]利用網(wǎng)絡藥理學分析了苦參止痢顆粒治療仔豬腹瀉的有效成分及作用機制，陳志飛[22]研究了黃芪防控豬繁殖與呼吸綜合征的物質(zhì)基礎及靶點信息，均是中獸醫(yī)藥領域通過網(wǎng)絡藥理學手段對中藥復方進行的有益探索。中獸醫(yī)學具有整體觀念和辨證論治的中醫(yī)理論特點，中藥復方通過多組分、多途徑、多靶點協(xié)同發(fā)揮作用；中藥網(wǎng)絡藥理學則是對藥物分子-靶點-疾病構(gòu)建的生物信息網(wǎng)絡進行綜合分析，從而識別中藥的有效成分，闡釋其作用機制，兩者不謀而合，為中獸藥的開發(fā)提供了新的研究思路和手段[23]。

研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素、槲皮素等通過干擾PEDV復制影響感染初期，具有抗豬流行性腹瀉的活性，與化學藥物利巴韋林、干擾素-α等相比，具有低毒高效的優(yōu)勢[24,25]。對LPS誘導的氧化應激體外實驗[26]發(fā)現(xiàn)，木犀草素具有抗氧化和抗菌活性，能有效地保護豬腸上皮細胞抵抗革蘭氏陰性菌，預防和治療豬胃腸道感染；通過減緩體重減輕，降低腹瀉評分，抑制十二指腸、結(jié)腸的絨毛縮短、空泡化，促進粘液蛋白的生成，預防和治療小鼠腸黏膜炎引起的腸道損傷[27]。槲皮素作為天然抗氧化劑，可緩和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇誘導的家畜胃腸道細胞毒性和氧化應激反應，通過促進腸上皮細胞Nrf2蛋白豐度、調(diào)節(jié)GSH相關(guān)氧化還原穩(wěn)態(tài)來減輕腸細胞損傷，對弗氏志賀菌誘導的大鼠感染性腹瀉，槲皮素顯著降低糞便密度和含水量，并恢復血液參數(shù)、抗氧化狀態(tài)和促炎細胞因子(IL-6和TNF-α)表達，這些發(fā)現(xiàn)證實槲皮素在維持腸道穩(wěn)態(tài)中的作用和有效的抗腹瀉活性[28-30]。山奈酚具有抗氧化、抗凋亡等多種生物活性，能夠改善豬腸上皮細胞的氧化損傷和凋亡，減輕腸屏障功能障礙[31]。

TNF-α是導致胃腸道炎癥易感和惡化的主要介質(zhì)，可在受損的腸粘膜中大量表達，表達量越高，其病變范圍越大、越嚴重，仔豬感染腹瀉后，TNF-α顯著提高了IL-6和IL-8的表達水平，促炎細胞因子通過直接誘導信號分子或間接刺激細胞增殖，從而在免疫應答中發(fā)揮重要作用[32]。

通路分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-17信號通路是苦白石顆粒治療仔豬細菌性腹瀉過程中最重要的信號通路之一，該通路在急、慢性炎癥反應中起著舉足輕重的作用，IL-17 是T細胞誘導的炎癥反應的早期啟動因子，可以促進T 細胞的激活和刺激上皮細胞等產(chǎn)生多種細胞因子如IL-6、IL-8、CAM-1等，放大炎癥反應[33]。另外，多種胃腸道疾病的病因與氧化應激有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)藥物作用使HIF-1信號通路中HIF-1α表達降低，下游COX-2的表達上調(diào)，表明腸粘膜對缺氧的適應性反應，減輕了仔豬腸道的損傷[34]。

從網(wǎng)絡藥理學的角度探討了苦白石顆粒在仔豬細菌性腹瀉防治中的有效成分及作用機制，并利用分子對接技術(shù)進行了初步驗證，木犀草素、槲皮素、山奈酚等活性成分作用于TNF、VEGFA IL6、IL8、ICAM-1、SERPINE1、MMP1、MMP3等靶點，進而調(diào)控IL-17、HIF-1等信號通路，參與抑制炎癥反應、調(diào)節(jié)免疫、抗感染等生物過程。下一步將通過實驗驗證的方法對苦白石顆粒作用的靶點和通路進行充分研究。