王軍鋒*，李安，閆璐璐，張慧君，龐興萍，曹文玉

1. 陜西學(xué)前師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院（西安 710100）；2. 山東省青島市實(shí)驗(yàn)高級(jí)中學(xué)（青島 266109）

作為嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)獲取的主要來(lái)源，奶粉與嬰幼兒的身體健康息息相關(guān)。隨著市場(chǎng)的多樣化，奶粉市場(chǎng)魚龍混雜，劣質(zhì)奶粉可能會(huì)對(duì)嬰幼兒的成長(zhǎng)發(fā)育造成不可逆的傷害。近年來(lái)，因奶粉質(zhì)量問(wèn)題而造成嬰幼兒出現(xiàn)“大頭嬰”、性早熟、腎結(jié)石等問(wèn)題屢見(jiàn)不鮮，因此為保護(hù)兒童茁壯成長(zhǎng)，奶粉的質(zhì)量檢測(cè)尤為重要。喹諾酮作為一種常見(jiàn)的抗菌藥，針對(duì)細(xì)菌的DNA，抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶，有效阻礙DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而抑制其繁殖，達(dá)到消滅細(xì)菌及衣原體等病原體的目的[1-7]。因該藥物具有殺菌強(qiáng)、抗菌廣、作用快、作用廣泛及與其他抗生素?zé)o交叉耐藥性等優(yōu)點(diǎn)[8-10]，對(duì)防治細(xì)菌性感染等有著極大的效果，被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)疾病防治。再加上飼養(yǎng)員缺乏生態(tài)養(yǎng)殖觀念及相關(guān)知識(shí)，存在亂用、濫用、超量長(zhǎng)期使用獸藥的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響奶粉的來(lái)源——牛肉、羊肉等的質(zhì)量安全，從而使奶粉受到抗生素的污染。長(zhǎng)期服用含有喹諾酮?dú)埩舻哪谭蹠?huì)使藥物在嬰幼兒體內(nèi)堆積，產(chǎn)生細(xì)菌的耐藥性，對(duì)人體多處產(chǎn)生慢性傷害，產(chǎn)生不良反應(yīng)[7]。所以多種喹諾酮類藥物被歐美、日本、聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織等列入獸藥殘留檢測(cè)名單。2002年原農(nóng)業(yè)部也規(guī)定幾種喹諾酮藥物的最高殘留限量[11-13]?；谏鲜鲈?，檢測(cè)奶粉中喹諾酮類藥物的殘留就變得十分關(guān)鍵。喹諾酮藥物殘留檢測(cè)手段主要有色譜法、免疫分析法、化學(xué)發(fā)光法、微生物抑制法等[14-16]。相比之下，色譜法具靈敏度好、分離度高、準(zhǔn)確性高、同時(shí)高效檢測(cè)等特點(diǎn)[17-19]。高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用，自動(dòng)化程度高，更兼具質(zhì)譜儀良好的化合物識(shí)別能力、適用范圍廣、準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于某些檢測(cè)樣品不穩(wěn)定、大分子、極性強(qiáng)的特點(diǎn)也能較好的分離和檢測(cè)。

試驗(yàn)采用先進(jìn)的HPLC-MS技術(shù)，建立一種快速高效精確檢測(cè)奶粉中喹諾酮藥物殘留量的方法，并為喹諾酮等抗生素的濫用治理提出建議。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

哇哈哈飲用純凈水（二次去離子水，哇哈哈基團(tuán)有限公司）；恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 mg/L甲醇溶液，上海安譜實(shí)驗(yàn)有限公司）；環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品（100 mg/L甲醇溶液，上海安譜實(shí)驗(yàn)有限公司）；諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品（100 mg/L甲醇溶液，上海安譜實(shí)驗(yàn)有限公司）；雀巢怡運(yùn)全家營(yíng)養(yǎng)奶粉（雙城雀巢有限公司）。

甲酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；冰乙酸（分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；乙腈、甲醇（均為色譜純，Honeywell Burdick＆ Jackson公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

6460 Triple Quad LC-MS（美國(guó)安捷倫公司）；Agilent Eclipse Plus C18RRHD 1.8 μm色譜柱（2.1 mm×50 mm，美國(guó)安捷倫公司）；離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；移液槍及槍頭（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；一次性無(wú)菌注射器（上?？档氯R企業(yè)發(fā)展集團(tuán)股份公司）；0.22 μm有機(jī)濾膜（杉羽天津科技發(fā)展有限公司）；超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 配制溶液

1.3.1.1 流動(dòng)相

移取甲酸、乙腈及水，混勻超聲。分別配制0.1%甲酸水溶液，0.1%甲酸乙腈溶液。

1.3.1.2 洗針液

移取乙酸和乙腈溶液，混勻，配制1%乙酸乙腈溶液。

1.3.1.3 定容液

移取乙腈、甲酸和去離子水，混勻，超聲15 min，配制成0.1%甲酸-10%乙腈水溶液。

1.3.1.4 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液

以定容液作為溶劑，分別移取環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品、諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品，各配制質(zhì)量濃度為500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，混勻后低溫避光保存。

1.3.1.5 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液

以定容液為溶劑，分別移取適量的3種藥物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，混勻，配制一系列濃度為2.5，5.0，10，20和50 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 色譜條件

柱溫25 ℃；流速0.250 mL/min；最大壓力限400.00 bar；進(jìn)樣量5.00 μL；進(jìn)樣模式采用Flush Port洗針2 s；流動(dòng)相A相為0.1%甲酸水溶液，B相為0.1%甲酸乙腈溶液；流動(dòng)相梯度洗脫如表1所示。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫

1.3.3 質(zhì)譜條件

ESI+離子源；離子源氣體溫度350 ℃；氣體流速10 L/min；毛細(xì)管電壓4 000 V；霧化器壓力40 psi；質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描模式。喹諾酮類藥物質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 喹諾酮類藥物質(zhì)譜參數(shù)

1.3.4 樣品前處理

1.3.4.1 樣品空白

用分析天平稱取2.010 5 g奶粉，用量筒量取20 mL 1%乙酸乙腈溶液，混勻振搖20次，超聲15 min，出現(xiàn)大量白色顆粒沉淀。用移液槍移液于離心管中，并設(shè)置離心機(jī)參數(shù)：4 ℃，5 000 r/min，離心5 min。用移液槍移取少量上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在45～55 ℃水浴下，恒定轉(zhuǎn)速約為90～100 r/min，將乙腈濃縮至干。往旋蒸瓶中加入適量的定容液復(fù)溶樣品，采用一次性無(wú)菌注射器，吸取溶液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，濾液待測(cè)。

1.3.4.2 樣品加標(biāo)

用移液槍移取500 μL樣品，移取500 μL 10 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)混合液，配成1 mL加標(biāo)絕對(duì)量5 ng的樣品加標(biāo)液。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化色譜條件

2.1.1 流動(dòng)相的選取

喹諾酮類藥物具有羧基和叔胺基，呈現(xiàn)酸堿兩性。流動(dòng)相中加入甲酸：其一，可以減小在氫鍵或離子交換作用下硅羥基對(duì)喹諾酮堿性基團(tuán)產(chǎn)生的強(qiáng)烈吸附而造成譜圖出現(xiàn)保留值不穩(wěn)定、色譜峰拖尾、分離度下降和峰形異常等現(xiàn)象[20]；其二，甲酸可使3種喹諾酮類化合物及其碎片結(jié)合1個(gè)質(zhì)子，呈現(xiàn)正電性，計(jì)算質(zhì)荷比，由此可以用質(zhì)譜進(jìn)行化合物的鑒定。乙腈作為有機(jī)流動(dòng)相具有黏度低、使用方便、更高的洗脫能力和與樣品不相互作用等優(yōu)點(diǎn)。長(zhǎng)期使用緩沖鹽易造成結(jié)晶析出從而導(dǎo)致色譜柱柱壓升高，化合物保留時(shí)間不準(zhǔn)等負(fù)面影響，故未在流動(dòng)相中選用緩沖鹽體系。

2.1.2 色譜柱的選取

試驗(yàn)選用Agilent Eclipse Plus C18RRHD 1.8 μm色譜柱（2.1 mm×50 mm），此柱是十八烷基鍵合硅膠柱，能高效分離且在pH 2～9范圍內(nèi)對(duì)酸性、堿性和中性化合物提供高性能和良好的對(duì)稱峰。

2.1.3 運(yùn)行時(shí)間的選取

選取的色譜柱長(zhǎng)度是50 mm且3種喹諾酮藥物保留時(shí)間大約都在2～3 min內(nèi)，故運(yùn)行時(shí)間不可設(shè)置過(guò)長(zhǎng)。過(guò)長(zhǎng)的情況下，3種喹諾酮藥物在3 min以內(nèi)就流出色譜柱，余下時(shí)間體系內(nèi)只有流動(dòng)相，浪費(fèi)時(shí)間及溶劑。

2.1.4 流動(dòng)相梯度洗脫選取

在梯度洗脫開(kāi)始的時(shí)候，設(shè)置90%的水相和10%有機(jī)相沖洗色譜柱，目的為保證色譜柱中無(wú)雜質(zhì)污染，色譜結(jié)果準(zhǔn)確。因其藥物流入色譜柱時(shí)間與流動(dòng)相執(zhí)行洗脫程序的時(shí)間相比有延后現(xiàn)象，試驗(yàn)3種目標(biāo)化合物均在2.6 min左右開(kāi)始出峰，所以在1 min左右開(kāi)始增加有機(jī)相的比例，為讓目標(biāo)化合物的峰形更好，分離好。最后采用與初始梯度洗脫濃度相同的流動(dòng)相沖洗，防止對(duì)后續(xù)進(jìn)樣干擾。

2.1.5 流速參數(shù)的選取

流速設(shè)置過(guò)快會(huì)使藥物很快就被流動(dòng)相沖走，導(dǎo)致保留時(shí)間減小且易出現(xiàn)3種藥物分離不明顯的現(xiàn)象，色譜結(jié)果不準(zhǔn)確。優(yōu)化后流速設(shè)置為0.250 mL/min。

2.1.6 進(jìn)樣量的選取

溶劑效應(yīng)是指溶解樣品的溶劑對(duì)色譜結(jié)果產(chǎn)生影響，使色譜峰出現(xiàn)前伸、拖尾、分裂等現(xiàn)象。為減小溶劑效應(yīng)，采取2種措施。減小進(jìn)樣量體積，優(yōu)化后設(shè)置為5.00 μL；配制與初始流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度相近的0.1%甲酸10%乙腈水溶液作為定容液來(lái)溶解3種喹諾酮類藥物。

2.2 優(yōu)化質(zhì)譜條件

恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星在ESI+的條件下易于斷裂，產(chǎn)生碎片離子峰。相比于母離子的質(zhì)荷比，碎片離子峰都丟失18 u，44 u。恩諾沙星的主要碎片離子m/z為316.1和342.1，其分別對(duì)應(yīng)著[M+H-CO2]+和[M+H-F]+。環(huán)丙沙星的主要碎片離子為m/z288.1和m/z314.2，其分別對(duì)應(yīng)著[M+H-CO2]+和[M+H-F]+。諾氟沙星的主要碎片離子為m/z275.9和m/z302.1，其分別對(duì)應(yīng)著[M+H-CO2]+和[M+H-F]+。其可能的碎裂機(jī)制如圖1～圖3所示。

圖1 恩諾沙星母離子可能的裂解機(jī)制

圖2 諾氟沙星母離子可能的裂解機(jī)制

圖3 環(huán)丙沙星母離子可能的裂解機(jī)制

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、定量限

采用5點(diǎn)校正繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將配制的一系列質(zhì)量濃度為2.5，5.0，10.0，20.0和50.0 ng/mL的恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品加標(biāo)溶液，經(jīng)過(guò)HPLC-MS檢測(cè)，以各自的峰面積對(duì)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量，得到線性方程。由圖4～圖6和表3可知，3種喹諾酮藥物在2.50～50.00 ng/mL區(qū)間內(nèi)響應(yīng)值與對(duì)應(yīng)藥物濃度具有良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)均大于0.996。

表3 3種喹諾酮藥物的線性方程、LOD、LOQ

圖4 10 ng/mL恩諾沙星的色譜圖、質(zhì)譜圖

圖6 10 ng/mL諾氟沙星的色譜圖、質(zhì)譜圖

圖5 10 ng/mL環(huán)丙沙星的色譜圖、質(zhì)譜圖

2.4 回收率

表4 奶粉樣品加標(biāo)回收率

將奶粉樣品加入3種喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)混合液配成加標(biāo)量5 ng/mL溶液進(jìn)行12次平行試驗(yàn)，測(cè)定加標(biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。以S/N=3為檢出限，以S/N=10為定量限。如圖7所示，定性離子對(duì)設(shè)置為最強(qiáng)信號(hào)離子對(duì)，定量離子對(duì)設(shè)置為次強(qiáng)信號(hào)離子對(duì)，以此繪制空白奶粉樣品加標(biāo)藥物的質(zhì)譜圖。

圖7 空白奶粉樣品中添加5 ng/mL恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)譜圖

3 結(jié)論與討論

鑒于當(dāng)今社會(huì)抗生素濫用嚴(yán)重，病菌易產(chǎn)生耐藥性變成“超級(jí)細(xì)菌”而危害人類健康，所以檢測(cè)抗生素殘留非常關(guān)鍵。運(yùn)用先進(jìn)的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，找到其最優(yōu)的色譜、質(zhì)譜條件，建立一種能夠快速、高效、同時(shí)檢測(cè)奶粉中3種喹諾酮類藥物的分析方法。該方法檢測(cè)3種藥物在2.50～50.00 ng/mL范圍內(nèi)具有線性，且相關(guān)系數(shù)均大于0.996，其中環(huán)丙沙星的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999。將奶粉前處理后，測(cè)得的加標(biāo)回收率分別為83.5%，90.2%和85.9%，SRSD分別為11.4%，14.0%和7.8%，檢出限分別為0.82，0.35和0.68 ng/mL，定量限分別為0.84，0.37和0.92 ng/mL。該方法符合獸藥殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，具有良好的應(yīng)用前景。