李 剛 ，楊少華 ，沈 甍 ，謝 楠 ，張貫博 ，王家興 ，李金淞

（1）成都市第七人民醫(yī)院肝膽外科，四川 成都 610213;2）昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽胰外科二病區(qū);3）消化內(nèi)科，云南 昆明 650101）

肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma iCCA）是第二高發(fā)的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤，占原發(fā)性肝臟惡性腫瘤的10%～15%[1-3]。近年來全世界范圍內(nèi)肝內(nèi)膽管癌的發(fā)病率和死亡率呈不斷上升的趨勢[4,5]，可能與非病毒性慢性肝病和代謝性疾病的普遍性增高有關(guān)[6,7]。肝內(nèi)膽管癌病死率高，5 a 生存率僅25%～30%[3]，其預(yù)后遠(yuǎn)差于肝細(xì)胞癌。真核翻譯起始因子5A2（eukaryotic translation initiation factor 5A2，EIF5A2）的編碼基因位于人3號染色體2 區(qū)6 帶[8]，該區(qū)域的染色體不穩(wěn)定，極易出現(xiàn)擴(kuò)增，導(dǎo)致其表達(dá)上調(diào)。EIF5A2 完成翻譯后需依次經(jīng)DHS 和DOHH 酶催化[9]，轉(zhuǎn)化為成熟的、有生物學(xué)活性的蛋白分子，可在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)間穿梭，負(fù)責(zé)特定mRNA 亞群的選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯[10]，其在胰腺導(dǎo)管腺癌、結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌中表達(dá)均增高[11]，與較低的生存率、高TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分化差等惡性表型顯著相關(guān)[12,13]。Ki67 可反映腫瘤細(xì)胞的增殖程度，用于預(yù)估患者預(yù)后[14]。本研究用免疫組織化學(xué)染色觀察EIF5A2 和Ki67 在肝內(nèi)膽管癌中的表達(dá)水平，分析它們在肝內(nèi)膽管癌中高表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集成都市第七人民醫(yī)院肝膽外科、昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科2014 年9 月至2021 年12 月行肝內(nèi)膽管癌根治手術(shù)患者的石蠟切片118 例，年齡38～74 歲，其中男性60 例，女性58 例，術(shù)后病理切片鏡下組織學(xué)特點(diǎn)并結(jié)合免疫組化（CK7、CK19、Glypican-3）確診為肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌，納入研究的患者病例資料完整。

1.2 HE 和免疫組化染色

對含腫瘤組織的蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片，取3 張連續(xù)的組織切片進(jìn)行HE 染色、EIF5A2 和Ki67免疫組化染色。HE 染色：含腫瘤組織的載玻片在65 ℃烤片機(jī)上烘烤25 min，之后浸泡在二甲苯溶液中脫蠟，然后洗滌二甲苯并進(jìn)行組織水化，蘇木精溶液染核5 min，自來水沖洗多余的蘇木精溶液，伊紅溶液染細(xì)胞質(zhì)2 min，脫水后封片。免疫組化染色：烤片、脫蠟、水化過程同HE 染色，腫瘤組織切片均進(jìn)行乙二胺四已酸抗原熱修復(fù)，高壓鍋內(nèi)煮沸5 min 后磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗組織切片5 遍，EIF5A2 免疫組化染色：載玻片上滴加EIF5A2 多克隆抗體（Abcam，貨號：ab227537，稀釋比：1∶150），Ki67 免疫組化染色使用即用型兔抗人單克隆抗體（福州邁新，產(chǎn)品編號：RMA-0542），組織切片中加入Ki67 一抗后放入37 ℃恒溫箱孵育1 h，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗5 遍，切片上滴加山羊抗兔的二抗，在37 ℃恒溫箱中孵育0.5 h，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗5 遍后DAB 顯色，蘇木素溶液染核后封片。

1.3 免疫組化染色結(jié)果判讀

EIF5A2 和Ki67 的表達(dá)強(qiáng)弱由2 名病理科主治醫(yī)師采用半定量計(jì)分法進(jìn)行分析，（1）評估腫瘤組織著色強(qiáng)度，基本無著色計(jì) 0 分（-），染色后呈淡黃色計(jì) 1 分（+），呈淺棕色計(jì) 2 分（++），呈棕褐色計(jì) 3 分（+++）；（2）評估染色面積，高倍鏡視野下以染色陽性區(qū)域的面積占整個(gè)視野面積的百分比進(jìn)行計(jì)分，面積小于5%計(jì)0 分，6%～25%計(jì)1 分，26%～50%計(jì)2 分，51 %～75%計(jì)3 分，＞76%計(jì)4 分；將染色強(qiáng)度①與染色面積②相加，所得結(jié)果0～3 分為低表達(dá)，4～7 分為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)；EIF5A2 和Ki67表達(dá)的相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE 染色及EIF5A2 和Ki67 在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)

118 例肝內(nèi)膽管癌組織標(biāo)本中HE 染色顯示，癌細(xì)胞核大且深染，異型性明顯，細(xì)胞質(zhì)紅染，腫瘤細(xì)胞排列成管狀，腫瘤組織間包含豐富的纖維間質(zhì)。免疫組化染色顯示EIF5A2 主要位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，Ki67 在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)，見圖1。

圖1 肝內(nèi)膽管癌HE 染色及EIF5A2、Ki67 免疫組化染色（×100，×200）Fig.1 Intrahepatic cholangiocarcinoma was stained with HE and immunohistochemical staining with EIF5A2 and Ki67（×100，×200）

2.2 EIF5A2 和Ki67 的表達(dá)與肝內(nèi)膽管癌臨床病理特征的關(guān)系分析

118 例肝內(nèi)膽管癌組織中EIF5A2 高表達(dá)60例（50.85%），Ki67 高表達(dá)81 例（68.64%），EIF5A2高表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)量無關(guān)（P＞ 0.05），與TNM 分期和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜ 0.05）；肝內(nèi)膽管癌組織中Ki67 高表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤數(shù)量無關(guān)（P＞ 0.05），與TNM 分期、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑有關(guān)（P ＜0.05），見表1。

表1 EIF5A2 和Ki67 表達(dá)水平與肝內(nèi)膽管癌臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]Tab.1 Relationship between EIF5A2 and Ki67 expression levels and clinicopathological features of intrahepatic cholangiocarcinoma [n（%）]

2.3 EIF5A2 和Ki67 在肝內(nèi)膽管癌中表達(dá)的相關(guān)性

118 例肝內(nèi)膽管癌免疫組化染色結(jié)果中EIF5A2 與Ki-67 兩種蛋白均為高表達(dá)者49 例，占 EIF5A2 高表達(dá)患者的81.67%（49/60），EIF5A2高表達(dá)而Ki-67 低表達(dá)的肝內(nèi)膽管癌組織切片11 例；EIF5A2 低表達(dá)但Ki-67 呈高表達(dá)的患者有32 例，占EIF5A2 低表達(dá)患者的55.17%（32/58），兩者均陰性者26 例；由χ2檢驗(yàn)得知，EIF5A2的表達(dá)與Ki-67 的表達(dá)呈正相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.285，P=0.002），見表2。

表2 EIF5A2 和Ki67 在肝內(nèi)膽管癌中表達(dá)的相關(guān)性Tab.2 Correlation of EIF5A2 and Ki67 expression in intrahepatic cholangiocarcinoma

3 討論

肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma iCCA）主要起源于膽管上皮細(xì)胞[15-16]，也可能起源于肝祖細(xì)胞[17]，近期的研究表明肝內(nèi)膽管癌也可能起源于HA-tag 陽性的肝細(xì)胞[18]。形態(tài)學(xué)可分為腫塊型、管周浸潤型和管內(nèi)型，依據(jù)分子學(xué)特征分為增殖型和炎癥型[19]。我國學(xué)者以肝內(nèi)膽管癌蛋白質(zhì)組學(xué)的表達(dá)差異，將肝內(nèi)膽管癌分為炎癥型、間質(zhì)型、代謝型和分化型[20]。肝內(nèi)膽管癌對放化療敏感性差[21]，缺乏有效的靶向治療和免疫治療，手術(shù)切除是唯一可達(dá)到根治的治療方式[22]，但手術(shù)后仍極易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，造成了患者5 a 生存率低，絕大多數(shù)肝內(nèi)膽管癌患者死亡是由于腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的，一項(xiàng)國際多中心的研究結(jié)果顯示肝內(nèi)膽管癌行根治性肝切除后復(fù)發(fā)率高達(dá)71%[23]。因此更好地了解肝內(nèi)膽管癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對于改善患者預(yù)后是極為重要的。

EIF5A2 是一個(gè)新的候選癌基因，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移[9,24]，在人類惡性消化道腫瘤中有所涉及，我們前期的研究其在肝內(nèi)膽管癌組織中表達(dá)增高[25]，但它與肝內(nèi)膽管患者的癌臨床病理特征的相關(guān)性尚未見報(bào)道。既往研究發(fā)現(xiàn)，EIF5A2 的高表達(dá)與這些胃癌患者的高TNM 分期、淋巴和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和較差的總生存期相關(guān)[12]；結(jié)腸癌中EIF5A2 的過表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的轉(zhuǎn)移[13]；此外Tang 等[26]報(bào)道，與未發(fā)生轉(zhuǎn)移或靜脈浸潤的HCC 組織相比，發(fā)生轉(zhuǎn)移或靜脈浸潤的HCC 組織中EIF5A2 的表達(dá)顯著增加。筆者的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)EIF5A2 的表達(dá)與年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)量無關(guān)（P＞ 0.05），與TNM 分期和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)（P ＜0.05），說明EIF5A2 增強(qiáng)了肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，與既往研究基本一致。一些腫瘤研究中報(bào)道了EIF5A2 增強(qiáng)癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的機(jī)制，結(jié)腸癌研究中發(fā)現(xiàn)高水平的EIF5A2 有助于c-myc 結(jié)合到MTA1 的啟動子區(qū)，進(jìn)而上調(diào)MTA1 蛋白的表達(dá)，從而增強(qiáng)了結(jié)腸癌細(xì)胞的運(yùn)動性和侵襲性[27]?；|(zhì)金屬蛋白酶在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性的作用[28,29]，皮膚黑色素瘤的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞核中EIF5A2 增多與強(qiáng)MMP2 表達(dá)直接相關(guān)[30]，促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。肝細(xì)胞癌中EIF5A2 可能通過激活 p38 MAPK 和JNK/c-Jun 通路增強(qiáng) MMP-2 活性促進(jìn)血管形成[31]，促進(jìn)腫瘤經(jīng)血道轉(zhuǎn)移。EIF5A2 在肝內(nèi)膽管癌中高表達(dá)，臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，筆者將進(jìn)一步研究EIF5A2 促肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。

Ki67 是評價(jià)細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)，也是實(shí)體瘤診斷和判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物，既往研究發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)膽管癌組織中Ki67 的表達(dá)遠(yuǎn)高于正常肝內(nèi)膽管組織[32]，本研究中Ki67 在肝內(nèi)膽管癌陽性表達(dá)率為68.64%（81/118），其表達(dá)與年齡、性別、腫瘤數(shù)量無關(guān)（P＞ 0.05），與TNM 分期、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑有關(guān)（P ＜0.05），與既往研究基本一致[33]，此外Qiang 等[14]在肝內(nèi)膽管癌的研究還發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的Ki67 與血管浸潤相關(guān)。在卵巢癌中發(fā)現(xiàn)，EIF5A2 的過表達(dá)與腫瘤分化差、高pT/pN和FIGO 分期以及Ki-67 的陽性率升高均有顯著的正相關(guān)[34]，同樣，筆者通過Spearman 相關(guān)性分析得知，肝內(nèi)膽管癌中EIF5A2 與Ki-67 的表達(dá)呈正相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.285，P=0.002），肝內(nèi)膽管癌中EIF5A2 是否直接調(diào)控Ki-67 及具體的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，肝內(nèi)膽管癌組織中EIF5A2、Ki67 的陽性率較高，兩者的表達(dá)呈正相關(guān)，其表達(dá)與高TNM 分期和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，說明EIF5A2和Ki67 促進(jìn)了肝內(nèi)膽管癌的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移，有助于預(yù)判肝內(nèi)膽管癌患者的臨床分期及預(yù)后。