廖周俊，楊少華，劉立鑫，胡 晟，陳軼暉，康 強，張小文

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽胰外科，云南 昆明 650101）

肝內(nèi)膽管癌是一種具有高度侵襲性的惡性腫瘤[1]，預(yù)后差，近年來，其發(fā)病率逐年升高[2]。腺苷酸激酶4（Adenylate kinase4，AK4）是腺苷酸激酶家族的一員，其分子量為25kDa，別稱為AK3L1。多項研究顯示AK4 促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3-5]。但其對肝內(nèi)膽管癌的作用尚無報道。本實驗通過小干擾RNA 手段，就AK4 對肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞HUCCT1 增殖、遷移能力的影響作出探究。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞系

本實驗所用肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞HUCCT1 購自上海譽馳生物科技有限公司，該細(xì)胞已通過中國科學(xué)院昆明動物研究所鑒定明確。該細(xì)胞作為肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株之一，常用于腫瘤增殖、遷移的研究。

1.2 小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）轉(zhuǎn)染細(xì)胞

本實驗采用siRNA 技術(shù)以沉默AK4。siRNA購自上海市吉瑪基因生物技術(shù)有限公司，共計構(gòu)建6 條si-RNA 序列，序列設(shè)計見表1。本次實驗分組為空白對照組（CON）、陰性對照組（siRNANC）、陽性對照 組（siRNA-GAPDH）、實驗組1（siRNA-AK4-1），實驗組2（siRNA-AK4-2），實驗組3（siRNA-AK4-3）。轉(zhuǎn)染試劑采用上海市吉瑪基因生物技術(shù)有限公司GP-transfect-Mate。采用免疫印跡法（Western Blot，WB）對實驗組1、實驗組 實驗組3 進(jìn)行si-RNA 篩選，其中空白對照組不添加siRNA，陰性對照組基因序列與目的基因序列無同源性，陽性對照組基因序列與內(nèi)參GAPDH 同源。各組間其余實驗操作步驟（轉(zhuǎn)染方法、WB、EdU、細(xì)胞劃痕實驗）均一致。

表1 si-RNA 序列Tab.1 Sequence of si-RNA built by siRNA technology

轉(zhuǎn)染前1 d 將HUCCT1 細(xì)胞接種至6 孔板中，以次日細(xì)胞融合度達(dá)到60%～80%為宜，用無抗生素的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染：（1）轉(zhuǎn)染試劑室溫備用；（2）按照每孔200 μL 無血清培養(yǎng)基（1640 培養(yǎng)基）加5～8 μL 轉(zhuǎn)染試劑配置轉(zhuǎn)染試劑混合物。靜置5 min；（3）按照每孔200 μL 無血清培養(yǎng)基（1640 培養(yǎng)基）加150/pmol siRNA 配置siRNA 混合物。靜置5 min；（4）將轉(zhuǎn)染試劑混合物滴加到siRNA 混合物中，混勻，靜置20 min；（5）20 min 后將混合液均勻加至6 孔板各孔中；（6）各孔另外加入1 600 μL 無抗生素完全培養(yǎng)基；（7）孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，使用免疫印跡檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.3 免疫印跡實驗檢測轉(zhuǎn)染效率及siRNA 篩選

（1）裂解細(xì)胞：使用PMSF（品牌：Beyotime，貨號：ST506-2 PMSF）與RIPA 裂解液（強）品牌：Beyotime，貨號：P0013B）按照200∶1 配置細(xì)胞裂解液。于冰上充分裂解細(xì)胞；（2）測蛋白濃度：取裂解產(chǎn)物于4 ℃離心機12 000 r/min，離心30 min。吸取86 μL 上清液，使用BCA 蛋白濃度測定試劑盒（品牌：Beyotime，貨號：P0012 500 次）測定蛋白濃度；（3）取80 μL 上清液加20 μL SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（品牌：Beyotime，貨號：P0015L）沸水加熱15 min；（4）電泳：配置12%下層膠，5%上層膠，蛋白上樣量為2.5 μg，上層膠60 V恒壓電泳，下層膠100 V 恒壓電泳；（5）轉(zhuǎn)膜：甲醇浸泡PVDF 膜，膠、膜放置妥當(dāng)后以300 mA恒流條件下濕轉(zhuǎn)發(fā)轉(zhuǎn)膜，時間為30 min；（6）封閉：PVDF 膜置于5%脫脂牛奶中封閉，緩慢搖晃，室溫封閉2 h；（7）：孵育一抗：兔單克隆抗體[EPR7678] to AK3L1 抗 體，（1∶7 000，品 牌：Abcam，貨號：ab131327）。一抗孵育過夜，4 ℃；（8）：孵育二抗：山羊抗兔IgG（H+L）（品牌：Proteintech，貨號：SA00001-2，1∶10 000），室溫孵育2 h；（9）顯影：ECL 化學(xué)發(fā)光液孵育1 min后，于成像儀中曝光顯影。

1.4 增殖EdU 實驗

（1）轉(zhuǎn)染細(xì)胞：6 孔板培養(yǎng)細(xì)胞。免疫印跡實驗已明確siRNA-AK4-3 的沉默效果最好，故本次實驗使用siRNA-NC 及siRNA-AK4-3 做細(xì)胞轉(zhuǎn)染。分組亦同。轉(zhuǎn)染完成24 h 開始進(jìn)行EdU 實驗。（2）工作液孵育：使用BeyoclickTMEdu-555配置2XEdU 工作液后（品牌：Beyotime，貨號：C0075s），與無抗生素完全培養(yǎng)基等體積加入六孔板中，孵育2 h。（3）：固定、染色：每孔1 mL 固定液固定15 min，洗滌后加入通透液孵育15 min，Click 反應(yīng)液孵育15 min，1X Hoechst 33342 溶液孵育10 min。（4）：熒光檢測：洗滌液清洗后于倒置熒光顯微鏡觀察。

1.5 細(xì)胞劃痕實驗

（1）轉(zhuǎn)染細(xì)胞：6 孔板培養(yǎng)細(xì)胞。本次實驗分組為siRNA-NC 及siRNA-AK4-3。轉(zhuǎn)染完成24 h開始細(xì)胞劃痕實驗。（2）畫線：使用直尺于6 孔板背面作橫行畫線。（3）劃痕：待細(xì)胞融合度為95%～100%時，使用200 μL 槍頭沿直尺作垂直于畫線的劃痕。（4）沖洗：使用PBS 沖洗孔板3 次，動作輕柔，吸凈PBS 后，加入無血清1640培養(yǎng)液。（5）拍照：每孔以“十”字交叉處上下為定點，于0 h，12 h，24 h，36 h 拍照，對比不同時間下各組細(xì)胞遷移能力，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析使用GraphPad Prism 8 及SPSS 26統(tǒng)計軟件，計量資料采用（），計數(shù)資料用t檢驗，3 組及多組計量資料采用單因素方差分析。所有檢驗取兩端。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA 轉(zhuǎn)染效率及篩選

免疫印跡法檢測各組后量化結(jié)果分別為：空白對照組（CON）：（0.9±0.01，）陰性對照組（siRNANC）：（0.92±0.01），陽性對照組（siRNA-GAPDH）：（0.95±0.04），實驗組1（siRNA-AK4-1）：（0.74±0.08），實驗組2（siRNA-AK4-2）：（0.45±0.04），實驗組3（siRNA-AK4-3）：（0.24±0.02）。免疫印跡結(jié)果顯示各組內(nèi)參齊，沉默效果較好，其中陽性對照組對GAPDH 的沉默效果顯著。各siRNA組中siRNA-AK4-3 對AK4 的沉默效果最好，見圖1，2。因此，后期實驗使用siRNA-NC 作為對照組，siRNA-AK4-3 作為實驗組。

圖1 各組中AK4 蛋白的Western Blot 條帶Fig.1 Western blot bands of AK4 protein in each group

2.2 增殖EdU 實驗

Edu 實驗結(jié)果顯示：siRNA-NC 組增殖細(xì)胞（15.9±4.4）/視野，細(xì)胞總數(shù)（110.9±22.4）/視野。siRNA-AK4-3 組增殖細(xì)胞數(shù)目（12.8±5.0）/視野，細(xì)胞總數(shù)（116.7±22.1）/視野。兩組增殖比率有差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。siRNA-NC 組增殖細(xì)胞多于siRNA-AK4-3 組，AK4 促進(jìn)細(xì)胞增殖，見圖3，4。

圖3 中EdU 中增殖的HUCCT1 細(xì)胞被標(biāo)記為siRNA-GAPDH 組為陽性對照，取GAPDH/AK4。各組分別與siRNA-NC 組比較，除CON 組無統(tǒng)計學(xué)差異其余各組均有統(tǒng)計學(xué)差異。**P＜ 0.01，***P＜ 0.005，****P＜ 0.001。紅色熒光，Hoechst 33342 中藍(lán)色熒光標(biāo)記的為視野下所有活細(xì)胞，Merge 圖由EdU 和Hoechst 33342 圖像合并后得到。

圖2 各組細(xì)胞中AK4 蛋白的相對表達(dá)量Fig.2 The relative expression level of AK4 protein in each group

圖3 EdU 檢測siRNA-NC 與siRNA-AK4-3 細(xì)胞的增殖情況（×200）Fig.3 The proliferation of siRNA-NC and siRNA-AK4-3 cells was detected by EdU（×200）

圖4 siRNA-NC 組與siRNA-AK4-3 的細(xì)胞增殖比率Fig.4 The proliferation rate of siRNA-NC group and siRNA-AK4-3

2.3 細(xì)胞劃痕實驗

劃痕實驗取劃痕面積/視野總面積，各組面積比見表2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖5，6。siRNA-NC 組細(xì)胞遷移面積較siRNA-AK4-3 組更大，AK4 促進(jìn)細(xì)胞遷移。

表2 劃痕面積比Tab.2 Scratch area ratio

圖5 siRNA-NC 與siRNA-AK4-3 細(xì)胞劃痕后面積變化，圖中紅色邊緣為Image J 軟件勾勒Fig.5 The area changes of siRNA-NC and siRNA-AK4-3 cells after scratches，and the red edge in the figure is outlined by Image J software

圖6 siRNA-NC 組與siRNA-AK4-3 組細(xì)胞劃痕后面積占視野總面積比的變化Fig.6 In the siRNA-NC group and siRNA-AK4-3 group，ns represented no difference in the ratio of cell area to total field area after scratches

3 討論

肝內(nèi)膽管癌的手術(shù)治療是極其重要的，目前全球范圍內(nèi)術(shù)后其平均無瘤生存時間（DFS）為12～ 36 個月[6-7]，但膽管癌起病隱匿，多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)疾病時已屬晚期[8]，據(jù)報道，肝內(nèi)膽管癌的根治切除率為30%～40%，其他肝膽惡性腫瘤均比此數(shù)據(jù)高[1，9]。肝內(nèi)膽管癌的輔助化療（吉西他濱聯(lián)合鉑類）在一定程度上實現(xiàn)腫瘤將期，從而獲得手術(shù)機會[10-12]，但其中位生存期仍然不到1 a 時間[13-15]。根據(jù)Andrew X Zhu 的RCT 臨床研究，靶向藥物Ivosidenib 使得患者有10.3 個月的中位生存期，而安慰劑組僅有7.5 個月[16]，Abou-Alfa GK 等學(xué)者也通過RCT 實驗研究了Ivosidenib在膽管癌中的作用，其結(jié)果是實驗組的無病生存期為2.7 個月（95% CI：1.6～4.2），而安慰劑組的無病生存期為1.4 個月（95% CI：1.4～1.6）[17]。A Demols 也在膽管癌的靶向治療上進(jìn)行了RCT 研究，他研究了靶向藥Regorafenib 對膽管癌作用，最終得出實驗組無病生存期為3.0 個月（95% CI：2.3～4.9），而對照組無病生存期為1.5 個月（95%CI：1.2～2.0），然而實驗組的總生存時間和對照組的總生存時間并無統(tǒng)計學(xué)差異[18]?？梢钥闯觯邢蛩幠芴岣呋颊呱鏁r間，但有研究顯示部分靶向藥并不能顯著提升患者的總生存率[18,19]。因此需尋找一個更有效的作用靶點。

1944 年，美國學(xué)者Kalckar 在實驗中首次發(fā)現(xiàn)了肌苷酸[20]。在隨后的科學(xué)實踐中，更名為腺苷酸激酶AK。AK4 定位于細(xì)胞線粒體基質(zhì)內(nèi)，在肝臟、心臟、腦、腎臟、胃腸道組織中富于表達(dá)[21]，AK4 在細(xì)胞能量代謝方面表現(xiàn)出特異性[22]，因此他與腫瘤應(yīng)該存在相關(guān)性。2012 年由臺灣地區(qū)學(xué)者Yi-Hua Jan 完成了首例AK4 與癌癥關(guān)系論證的研究：體外試驗中shRNA 沉默肺癌細(xì)胞CL1-5 和A549 中的AK4 后，兩株細(xì)胞的侵襲能力下降約50%，從而證實AK4 促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲[3]。連云港市的學(xué)者M(jìn)inMin HUANG 在研究中顯示AK4 在人漿液性卵巢癌組織中高表達(dá)。在體內(nèi)試驗中，AK4 敲低組的腫瘤體積明顯減小，腫瘤重量明顯減輕。這些試驗均顯示AK4 促進(jìn)了人漿液性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展[4]。Jie Zhang 等在Her-2 陽性乳腺癌中的研究顯示AK4 的表達(dá)水平與腫瘤TNM 分期（P=0∶017）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0∶046）顯著相關(guān)。體外試驗中，MTT 法、細(xì)胞劃痕實驗和Transwell 試驗都顯示敲低AK4 組的癌細(xì)胞增值、遷移、侵襲能力減弱。體外試驗也顯示敲低了AK4 的腫瘤組織體積減小，重量減輕[5]。此后AK4 與腫瘤的研究未曾斷絕，田華等學(xué)者通過免疫組化等方法證實了AK4 在肺腺癌中高表達(dá)[23]。李辰運的研究顯示AK4 在胰腺導(dǎo)管腺癌中高表達(dá)，并且與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)受侵、脈管內(nèi)瘤栓有相關(guān)性（P＜ 0.05）[24]。李紹軍等也證實AK4 在食管鱗狀細(xì)胞中高表達(dá)[25]，夏林等也通過免疫組化的方式證實了AK4 在胃癌中高表達(dá)[26]，盡管我國的多數(shù)學(xué)者都明確了AK4 在大多數(shù)腫瘤中的表達(dá)，但是很遺憾，僅有少數(shù)人通過體內(nèi)、體外實驗論證AK4 對相關(guān)癌癥的影響，無法將他們的研究進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為臨床制定治療方案的依據(jù)。

本實驗首次論證AK4 對肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞HUCCT1 增殖、遷移的影響。首先予siRNA 沉默AK4 的表達(dá)，再通過EdU 檢測細(xì)胞增殖能力，細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力。本次實驗的結(jié)論與前人的研究結(jié)論相似，即AK4 促進(jìn)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞HUCCT1 的增殖、遷移。本實驗的不足在于，筆者尚未完成AK4 對肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞其他生物學(xué)能力的影響，如EMT、侵襲等等。因此，筆者接下來即將完成其他細(xì)胞生物學(xué)行為實驗，并且探究在機制方面的變化以及通過體內(nèi)實驗驗證結(jié)論。本實驗結(jié)論將為肝內(nèi)膽管癌的臨床分子靶向治療提供基礎(chǔ)實驗數(shù)據(jù)，采用生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)干預(yù)肝內(nèi)膽管癌組織中AK4 的表達(dá)，將有助于腫瘤的綜合治療。