李 瑞 應彥祺 張文藝 魯笑欽

宮頸癌(cervical cancer，CC)的發(fā)生率和病死率居高不下，在女性腫瘤中位居第4位，且多數(shù)集中在發(fā)展中國家和地區(qū)[1]。大規(guī)模推進HPV疫苗注射、宮頸癌的早篩早診，在一定程度上減輕了患者的疾病負擔。早期宮頸癌患者主要采用手術治療，其5年生存率為88%～97%[2]。中晚期及復發(fā)性宮頸癌的預后更差。我國于2019年公布了《健康中國行動——癌癥防治實施方案(2019-2022年)》，其主要目標要求總體癌癥5年生存率比2015年提高3個百分點[3]。

近年來，隨著基因芯片和高通量測序蓬勃發(fā)展，生物信息學技術為疾病研究提供了新手段[4]。因此筆者通過GEO數(shù)據(jù)庫篩選正常宮頸組織與宮頸癌組織的基因表達數(shù)據(jù)集，分析兩組樣本間的差異表達基因，構建蛋白質互作(protein-protein interaction， PPI)網絡。通過Cytoscape可視化PPI網絡，然后篩選出CDK1、CCNA2、CCNB1、CDC20和TOP2A等5個核心基因。通過分析核心基因的甲基化水平、拷貝數(shù)變異、免疫浸潤等，探索其在宮頸癌中的潛在作用機制，為宮頸癌的診斷、治療提供新的研究基礎。

材料與方法

1.數(shù)據(jù)集獲?。阂浴癱ervical cancer”為關鍵詞在GEO數(shù)據(jù)庫中檢索與宮頸癌相關的基因表達數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)集納入標準：①同一數(shù)據(jù)集包含正常宮頸組織和宮頸癌組織；②組織樣本對HPV感染無限制；③患者術前未接受過放化療；④數(shù)據(jù)集包含mRNA數(shù)據(jù)。最終選擇了5個基因芯片數(shù)據(jù)集(GSE63514、GSE64217、GSE6791、GSE89657和GSE9750)，共計宮頸癌樣本85例，正常宮頸樣本61例。

2.差異表達基因的獲取與分析：利用在線工具GEO2R分析每個數(shù)據(jù)集中宮頸癌組織與正常宮頸組織之間的差異表達基因(differential expressed genes，DEGs)。DEGs需滿足2個標準：①校正后P<0.05；②|log2FC|>1.0。利用Venn diagram網站找出不同數(shù)據(jù)集DEGs的交集。

3.PPI網絡構建及核心基因篩選：利用STRING在線工具進行DEGs的PPI網絡構建，設置最低關聯(lián)度為0.90。利用Cytoscape軟件(v3.8.2)將PPI網絡進行可視化，通過MCODE插件篩選PPI中的緊密連接的基因模塊。利用Degree算法對模塊涵蓋的基因進行排序，選排名前15%的基因作為核心基因。

4.核心基因的表達驗證及機制探索：利用GEPIA2在線工具分析基因的mRNA表達水平，該網站收錄了宮頸癌樣本306例，正常宮頸樣本13例。使用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析基因的甲基化水平；使用cBioPortal數(shù)據(jù)庫進行基因拷貝數(shù)變化分析；使用TIMER數(shù)據(jù)庫對基因進行免疫浸潤分析；使用TISIDB數(shù)據(jù)庫對基因進行免疫分型分析。

結 果

1.差異基因的確認：本研究選取了5個數(shù)據(jù)集GSE63514、GSE64217、GSE6791、GSE89657和GSE9750，利用GEO2R對其進行差異基因的篩選(表1)。利用Venn在線工具分析5個數(shù)據(jù)集差異基因的交集，最終得到90個差異表達基因，包括67個上調基因和23個下調基因。

表1 GSE基本信息(n)

2.構建PPI網絡并確認核心基因：將90個差異表達基因導入STRING工具，進行PPI分析。預測DEGs之間的蛋白質相互作用。該PPI網絡共涉及90個節(jié)點與1036條邊(圖1 A)。在Cytoscape中，利用MCODE算法篩出PPI中3個基因模塊，涵蓋35個基因(圖1中B、C、D)。利用Degree算法對模塊中35個基因進行排序，選排名前15%的基因作為核心基因，分別為CDK1(Degree=46)、CCNA2(Degree=38)、CCNB1(Degree=36)和CDC20(Degree=36)和TOP2A(Degree=34)。按照納入的數(shù)據(jù)集分析，以上5個核心基因在宮頸癌中均為高表達。

圖1 蛋白質互作網絡圖

3.核心基因的表達驗證：為了驗證5個核心基因的表達水平，筆者用GEPIA2在線工具對其進行表達分析。與正常宮頸組織比較，5個核心基因的mRNA水平在宮頸癌組織中均呈現(xiàn)高表達(圖2)。

圖2 驗證核心基因表達水平

4.核心基因拷貝數(shù)變異影響其mRNA表達水平：為探索核心基因CDK1、CCNA2、CCNB1、CDC20和TOP2A在宮頸癌中高表達的原因，筆者使用UALCAN數(shù)據(jù)庫進行啟動子甲基化分析。結果表明宮頸癌樣本中CCNA2啟動子甲基化水平高(P=0.004，圖3中B)，CDK1、CCNB1、CDC20和TOP2A啟動子的甲基化水平無顯著異常(P均>0.05，圖3中A、C、D)。使用cBioPortal分析基因拷貝數(shù)變異，主要包括擴增、輕度擴增、二倍體、輕度丟失、深度丟失等5種改變。結果提示，隨著核心基因拷貝數(shù)值增加，其mRNA水平增加(P<0.05，圖4)。

圖3 宮頸癌中核心基因的甲基化分析

圖4 核心基因拷貝數(shù)值與mRNA表達水平的關系

5.核心基因的免疫相關分析：使用TIMER在線工具對核心基因進行免疫浸潤分析，分析內容包括腫瘤純度、B淋巴細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞。結果顯示核心基因的表達與腫瘤純度有關(P<0.05)，與CD8+T細胞、CD4+T 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞浸潤有關(P<0.05)。其中CDK1的表達與巨噬細胞浸潤呈負相關(圖5 A)；CCNA2的表達與CD4+T細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞浸潤呈正相關，與巨噬細胞浸潤呈負相關(圖5 B)；CCNB1的表達與所分析的免疫細胞無顯著關聯(lián)(圖5 C)；CDC20的表達與CD8+T細胞浸潤呈負相關(圖5 D)；TOP2A的表達與CD4+T細胞浸潤呈正相關(圖5 E)。使用TISIDB在線工具對核心基因進行免疫分型分析，免疫分型主要分為C1(創(chuàng)面愈合)、C2 (IFN-γ顯性)、C3(炎性)、C4(淋巴細胞消耗)、C5(免疫沉默)和C6 (TGF-β顯性)等6種亞型。結果顯示，宮頸癌主要包含C1、C2、C4等3種亞型，僅CCNA2的表達與免疫分型的相關性比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CDK1、CCNA2、CCNB1和CDC20在C2型中表達水平相對較高，TOP2A在C1型中表達水平相對較高(圖6)。

圖5 核心基因在宮頸癌中的免疫浸潤分析

圖6 核心基因與宮頸癌免疫分型的關系

討 論

對于大多數(shù)發(fā)展中國家和地區(qū)，CC發(fā)生率、病死率居高不下，其診斷與治療仍具有局限性。因此急需拓展新的生物學標志物協(xié)助宮頸癌的診治，探索宮頸癌的發(fā)生機制。隨著高通量測序技術的發(fā)展，生物信息學技術為癌癥的研究提供了新的思路。

本研究通過生物信息分析篩選出CDK1、CCNA2、CCNB1、CDC20和TOP2A等5個基因可作為宮頸癌候選生物學標志物。CDK1(cyclin dependent kinase 1)即細胞周期依賴性激酶1，對細胞分裂和DNA復制至關重要，幾乎可以促進所有類型細胞的細胞周期進展，在多數(shù)腫瘤中為高表達。敲除肝癌小鼠模型的CDK1基因，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長顯著受到抑制[5]。研究表明，CDK1可以通過磷酸化人端粒酶反轉錄酶影響細胞分化和癌癥進展[6]。CCNA2(cyclin A2)即細胞周期蛋白A2，可以影響細胞的G1/S期轉換和G2/M期轉換，與多種腫瘤預后相關，如前列腺癌、胰腺癌等[7～9]。CCNB1(cyclin B1)即細胞周期蛋白B1，是CDK1的主要激活劑，二者協(xié)同促進G2/M期轉換[10]。在胰腺癌中，沉默CCNB1可激活p53信號通路進而抑制細胞增殖并促進細胞衰老[11]。CDC20(cell division cycle 20)即細胞分裂周期蛋白20，是細胞周期檢查點調節(jié)蛋白，影響細胞分裂、染色體分離，在多種惡性腫瘤中上調，包括肝癌、胰腺導管癌和胃癌[9, 12～14]。抑制CDC20的表達可抑制膠質瘤耐藥細胞系的上皮間充質轉化并影響其增殖[15]。TOP2A(DNA topoisomerase Ⅱ alpha)即DNA拓撲異構酶2A，影響DNA合成和轉錄、染色體分離[16]。TOP2A可作為S期、G2期、M期時細胞增殖的特異性標志物，其高表達與癌癥預后不佳有關[17]。

癌癥本質上是一種基因組疾病，隨著體細胞的突變累積而發(fā)展，包括拷貝數(shù)改變(copy-number alterations，CNA)和結構變異(structural variants，SV)以及伴或不伴有遺傳性的表觀基因組改變?；蚩截悢?shù)改變是癌癥基因組最常見的標志之一，可導致癌基因的激活和抑癌基因的失活[18]。DNA甲基化是人類基因組最主要的表觀遺傳變異，細胞癌變的過程總是伴隨著廣泛的DNA甲基化改變[19, 20]。為進一步探討5個核心基因CDK1、CCNA2、CCNB1、CDC20和TOP2A在宮頸癌中的潛在機制，筆者選擇從啟動子甲基化及基因拷貝數(shù)兩方面入手。與正常宮頸組織比較，宮頸癌組織中CCNA2啟動子高甲基化，而CDK1、CCNB1、CDC20和TOP2A的啟動子甲基化差異無統(tǒng)計學意義，因此核心基因高表達并非源于啟動子甲基化。值得注意的是，5個核心基因的拷貝數(shù)值與mRNA表達水平均呈正相關，因此推測宮頸癌核心基因高表達源于基因拷貝數(shù)的改變。有研究表明，在放射抗性的前列腺癌細胞中，CDK1基因拷貝數(shù)和表達量均增加[21]。在膠質母細胞瘤中CUL2基因通過拷貝數(shù)變異調節(jié)其表達量，可預測腫瘤進展及放射敏感度[22]。在膀胱尿路上皮癌中，TOP2A基因拷貝數(shù)變異是癌癥復發(fā)的獨立危險因素[23]。未來探索基因拷貝數(shù)變異的機制有助于推動宮頸癌的診治。

腫瘤進展需要克服的主要障礙是免疫系統(tǒng)。免疫系統(tǒng)將腫瘤視為新出現(xiàn)的病原體，并意圖消除腫瘤[24]。了解腫瘤免疫對于完善當前的免疫治療方案至關重要。本研究發(fā)現(xiàn)核心基因與宮頸癌免疫浸潤有關。在腫瘤微環(huán)境中涉及多種免疫細胞，如自然殺傷細胞、調節(jié)性T細胞、肥大細胞等，本研究僅分析了B淋巴細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞等6種免疫細胞。結果表明5個核心基因的表達與B淋巴細胞浸潤均不相關，CCNA2涉及較多免疫細胞浸潤，包括CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞。可能由于分析種類不全，所以本研究未見CCNB1與免疫細胞浸潤關系。2018年，Thorsson等[25]開發(fā)了新的免疫分類，包含6種免疫亞型，分別為C1型(創(chuàng)面愈合)、C2 型(IFN-γ顯性)、C3型(炎性)、C4型(淋巴細胞消耗)、C5型(免疫沉默)和C6型(TGF-β顯性)。在不同的腫瘤中，不同的免疫分型預后不同，C4型和C6型的腫瘤患者預后較差。在結直腸癌中免疫分型主要是C1型和C2型，不同的免疫亞型造成不同的生物學差異，這可能是患者對傳統(tǒng)細胞毒性藥物和免疫療法存在藥物異質性的原因[26]。

本研究中核心基因與宮頸癌免疫分型有潛在關系，主要涉及C1(創(chuàng)面愈合)、C2 (IFN-γ顯性)、C4(淋巴細胞消耗)等3種亞型，其中C2型與核心基因的表達關系較為密切。已有研究顯示C1型表現(xiàn)出血管生成基因高表達、高增殖性、與適應性免疫相關的Th1/Th2比值低；C2型表現(xiàn)出腫瘤細胞高增殖性、最高的腫瘤異質性、巨噬細胞M1/M2的高極化狀態(tài)、CD8 T細胞群占比最大，T淋巴細胞多樣性最大。C4型表現(xiàn)為腫瘤細胞適度的增殖性及異質性、伴Th1抑制和高M2反應的巨噬細胞顯著特征[26]。核心基因與C2型免疫亞型關系密切，代表其與宮頸癌高增殖性、高腫瘤異質性、巨噬細胞不同的極化狀態(tài)密切相關。CDK1、CCNA2、CCNB1、CDC20和TOP2A不同的表達水平可能與宮頸癌患者免疫細胞水平有關，甚至在一定程度上影響癌癥免疫分型，影響患者對傳統(tǒng)抗腫瘤藥物的反應及免疫療法的效用。

綜上所述，CDK1、CCNA2、CCNB1、CDC20和TOP2A可作為宮頸癌新的生物學標志物，其拷貝數(shù)改變影響基因表達水平，其mRNA表達水平與患者的免疫狀態(tài)相關聯(lián)，可能成為免疫治療的新靶點。未來仍需進一步研究予以證實核心基因的作用機制，為宮頸癌的診斷及治療帶來新的機遇。