胡鑫，羅正英，趙培方，陸鑫，趙麗萍，劉洪博，吳轉(zhuǎn)娣，趙勇，張靜，任生林，吳才文，劉家勇

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/云南甘蔗遺傳改良重點(diǎn)試驗(yàn)室，云南開(kāi)遠(yuǎn) 661699）

0 引言

甘蔗是我國(guó)最主要的糖料作物，黑穗病是危害甘蔗生產(chǎn)的主要病害。目前我國(guó)蔗區(qū)普遍存在黑穗病，對(duì)蔗糖產(chǎn)業(yè)已造成了重大威脅[1-2]。甘蔗黑穗病菌可潛伏在甘蔗種莖內(nèi)，難以用常規(guī)物理或化學(xué)方法清除，通常認(rèn)為選用抗黑穗病甘蔗品種是防治黑穗病最為經(jīng)濟(jì)有效的方式。甘蔗屬野生種是改良商業(yè)品種抗性的重要親本來(lái)源，主要包括割手密（Saccharum spontaneum）和大莖野生種（S.robustum）。我國(guó)具有豐富的甘蔗野生種資源，也被認(rèn)為是割手密的起源地之一[3-4]。據(jù)國(guó)家甘蔗種質(zhì)圃統(tǒng)計(jì)，2010 年保存割手密資源624 份，占甘蔗屬野生種資源的97%，占甘蔗屬及甘蔗近緣屬的67%[5]。早在19 世紀(jì)初，育種家通過(guò)“高貴化”策略將割手密與栽培種雜交，育成了突破性甘蔗品種‘POJ2878’和‘Co419’[6]。因此，發(fā)掘和利用優(yōu)異抗黑穗病野生種質(zhì)（特別是割手密）有可能帶來(lái)甘蔗抗黑穗病育種的突破。

野生種黑穗病抗性鑒定與評(píng)價(jià)是育種創(chuàng)新利用的基礎(chǔ)。ALEXANDER等[7]通過(guò)對(duì)熱帶種和割手密進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)，鑒定出一批高抗黑穗病割手密種質(zhì)。BURNER等[8]對(duì)甘蔗屬6個(gè)種的102個(gè)無(wú)性系開(kāi)展抗黑穗病鑒定和評(píng)價(jià)研究，發(fā)現(xiàn)甘蔗近緣屬野生種蔗茅和割手密抗病性最強(qiáng)，而最易感病的是熱帶種和大莖野生種，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源割手密的黑穗病抗性有明顯差異，其中印度割手密抗病性最強(qiáng)，其次是印度尼西亞割手密和菲律賓割手密。SAKAIGAICHI 等[9]通過(guò)鑒定30 份日本割手密種質(zhì)的抗黑穗病性，結(jié)果表明人工接種后割手密黑穗病發(fā)病率分布范圍為0～71%，抗性反應(yīng)具有很大的變異。周耀輝等[10]針對(duì)海南育種場(chǎng)的割手密和斑茅進(jìn)行抗黑穗病鑒定，結(jié)果表明割手密抗性水平變異度大，不同來(lái)源或者同一原產(chǎn)地割手密的抗病性均表現(xiàn)不同。楊李和[11]對(duì)云南割手密、斑茅、滇蔗茅后代黑穗病抗性進(jìn)行研究，結(jié)果表明割手密種后代的黑穗病抗性表現(xiàn)優(yōu)秀，能夠顯著改善傳統(tǒng)感病種質(zhì)的抗性。

本研究對(duì)25 份農(nóng)藝性狀優(yōu)異的甘蔗野生種質(zhì)進(jìn)行黑穗病抗性鑒定與評(píng)價(jià)，旨在從中篩選優(yōu)良抗病材料，為甘蔗品種抗黑穗病遺傳改良提供優(yōu)異種質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試甘蔗材料名稱見(jiàn)表1，包括19 個(gè)割手密、6 個(gè)大莖野生種和3 個(gè)對(duì)照品種，對(duì)照品種分別為‘Q171’（高抗）、‘F134’（中抗）和‘新臺(tái)糖22 號(hào)’（感?。?；試驗(yàn)用種莖取自國(guó)家甘蔗種質(zhì)資源圃。冬孢子于2019 年采自云南省紅河哈尼族彝族自治州開(kāi)遠(yuǎn)市蔗區(qū)‘新臺(tái)糖22 號(hào)’，黑穗鞭子采后于室溫自然風(fēng)干4～5 d，用毛筆輕輕刮下鞭子上的冬孢子，充分混勻后分裝于小濾紙袋中，保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2 人工針刺接種鑒定

每個(gè)參試材料種莖砍成單芽段，接種前首先檢測(cè)孢子萌芽率（大于90%），參考沈萬(wàn)寬方法[12]對(duì)參試材料莖芽進(jìn)行針刺接種，黑穗病孢子濃度為5×106個(gè)/mL，接種菌液注射量以每株100μL。接種后材料種植于塑料桶（規(guī)格為直徑40 cm，高25 cm，底徑30 cm）里，每種植桶放8～10 芽，每個(gè)材料種植3 桶作為1 重復(fù)，共設(shè)3 重復(fù)。試驗(yàn)于2020年2 月桶栽于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所溫室大棚中。溫室條件為日溫25～35 ℃，夜溫13～20 ℃，空氣濕度30%～65%，光強(qiáng)度540～900μmol/（m2·s）。整個(gè)生長(zhǎng)季進(jìn)行正常澆水、施肥管理，噴灑殺菌類農(nóng)藥。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)收集與分析

從發(fā)生黑穗病株后定期調(diào)查基本苗數(shù)和發(fā)病株數(shù)，并將記錄后的甘蔗黑穗病株連根拔除，以免再侵染。連續(xù)調(diào)查4個(gè)月，每次統(tǒng)計(jì)發(fā)病株數(shù)和總株數(shù)。計(jì)算累計(jì)莖發(fā)病率（IS）、病情發(fā)展曲線下面積(area under the disease-progress curve，AUDPC）和sAUDPC值[13]。其計(jì)算公式如下：

公式中，xi表示第i次調(diào)查的黑穗病發(fā)病率，ti表示第i次調(diào)查的時(shí)間。應(yīng)用Excel 2007 和IBM SPSS Statistics 21 分析軟件[14]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。按照國(guó)家甘蔗黑穗病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程（GB/T35874-2018）進(jìn)行抗性分級(jí)[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 參試材料發(fā)病情況分析

28份參試材料的發(fā)病情況如表1和圖1 所示，2020 年參試割手密黑穗病發(fā)病率的分布范圍為0～100%，平均發(fā)病率為43.0%，中位數(shù)為40%；2021 年參試割手密黑穗病發(fā)病率的分布范圍為0～100%，平均發(fā)病率為35.1%，中位數(shù)為30%。2020 年參試大莖野生種黑穗病發(fā)病率的分布范圍為0～83.3%，平均發(fā)病率為34.5%，中位數(shù)為30%；2021 年參試割手密黑穗病發(fā)病率的分布范圍為0～87.5%，平均發(fā)病率為24.1%，中位數(shù)為10%。2020 年參試割手密AUDPC的分布范圍為0～53.3，平均發(fā)病率為21.5，中位數(shù)為18；2021 年參試割手密AUDPC 的分布范圍為0～78.1，平均發(fā)病率為26.6，中位數(shù)為20.8。2020 年參試大莖野生種AUDPC的分布范圍為0～51.7，平均發(fā)病率為19.1，中位數(shù)為12.7；2021 年參試割手密AUDPC 的分布范圍為0～68.4，平均發(fā)病率為17.3，中位數(shù)為8.0。

圖1 割手密和大莖野生種的黑穗病發(fā)病分布情況Fig.1 Distribution of smut reaction in S.spontaneum and S.robustum

表1 28 份參試材料針刺接種后病情指數(shù)分析和抗病評(píng)價(jià)Table 1 Analysis of smut reaction on plant cane and 1st ratoon after pinprick inoculation

兩個(gè)生長(zhǎng)季對(duì)照品種‘Q171’和‘F134’的抗病等級(jí)一致，對(duì)照品種‘新臺(tái)糖22 號(hào)’的抗病等級(jí)從9級(jí)變?yōu)?級(jí)，對(duì)照品種符合預(yù)期抗性水平，表明試驗(yàn)正常；兩個(gè)生長(zhǎng)季參試材料的抗病等級(jí)不完全一致，其中11份種質(zhì)的抗病等級(jí)不變，12 份材料的抗病等級(jí)變小，2份種質(zhì)的抗病等級(jí)變大。以發(fā)病等級(jí)高的鑒定結(jié)果為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)結(jié)果為高抗（HR）的參試材料有3 個(gè)，分別為‘云農(nóng)大2015-83’、‘NG77-004’和‘Q171’；抗病評(píng)價(jià)為抗?。≧）的材料僅‘云南83-1-81’，被鑒定材料抗性以上占12%；抗病評(píng)價(jià)為中感（MS）的材料有5 個(gè)，分別為‘泰國(guó)SP2003-2’、‘廣東35 號(hào)’、‘四川79-2-11’、‘51NG208’和‘51NG3’，占20%；抗病評(píng)價(jià)為感（S）的材料有10 個(gè)，分別為‘82-110’、‘廣東韶關(guān)大莖割手密’、‘云瑞1-16’、‘開(kāi)遠(yuǎn)割手密’、‘云南76-3-18’、‘廣東55號(hào)’、‘云南82-29’、‘大野’、‘51NG63’、和‘F134’，被鑒定材料占36%；而抗病評(píng)價(jià)為高感（HS）的材料有9份，分別為‘越南1號(hào)’、‘88-22’、‘老撾2 號(hào)’、‘廣東81號(hào)’、‘云南82-14’、‘云南蠻耗4 號(hào)’、‘廣東31號(hào)’、‘福建大野’和‘新臺(tái)糖22號(hào)’,被鑒定材料占32%。

2.2 2020和2021年抗黑穗病鑒定相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果如圖2所示，2020年累積莖發(fā)病率（IS）與2021 年IS的相關(guān)性為0.8179，2020 年AUDPC值與2021年AUDPC相關(guān)系數(shù)為0.7977，sAUDPC值相關(guān)系數(shù)為0.7974。結(jié)果表明2年間參試材料抗黑穗病表現(xiàn)高度相關(guān)，抗性鑒定穩(wěn)定性較好。綜合2020 年和2021 年IS 與AUDPC 值進(jìn)行相關(guān)分析，其相關(guān)系數(shù)為0.9434，表明IS與AUDPC值高度相關(guān)。

圖2 黑穗病流行參數(shù)的相關(guān)分析Fig.2 Correlation analysis of smut epidemic parameters

2.3 參試材料聚類分析

依據(jù)參試材料2020 年與2021 年的IS、AUDPC 與sAUDPC 進(jìn)行聚類分析。由于2020 與2021 年參試材料的IS、AUDPC與sAUDPC具有較高相關(guān)性，數(shù)據(jù)重疊影響聚類分析，先采用主成分分析提取主要特征值。結(jié)果如表2，大于1的主成分特征值僅為第一主成分λ1=5.379，方差貢獻(xiàn)率達(dá)89.652%，因此選取λ1 能夠代表最初的6個(gè)指標(biāo)來(lái)分析參試材料的抗黑穗病水平。

表2 甘蔗黑穗病主成分分析Table 2 Principal component analysis of sugarcane smut disease

第一主成分對(duì)所有指標(biāo)的載荷系數(shù)均大于0.9，因此第一主成分是對(duì)參試材料在新宿兩季的黑穗病情流行病學(xué)的綜合考量，可稱之為“綜合因子”。在綜合因子中，IS_2020、AUDPC_2020、sAUDPC_2020、IS_2021、AUDPC_2021、和sAUDPC_2021 均具有較強(qiáng)作用。提取該指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果如圖3所示，28份參試材料按抗性水平可分為5類，第1類是‘云農(nóng)大2015-83’、‘NG77-004’、‘Q171’、和‘云南83-1-81’共4個(gè)，兩年平均發(fā)病率分布范圍為0～3.6%，屬于高抗種質(zhì)；第2 類是‘51NG3’、‘泰國(guó)SP2003-2’、‘51NG208’、‘四川79-2-11’、‘云南76-3-18’、‘廣東35號(hào)’、‘云瑞1-16’、‘廣東韶關(guān)大莖割手密’、‘F134’、‘51NG63’和‘82-110’等共11 個(gè)，兩年平均發(fā)病率范圍為10.0%～34.2%；第3類是‘云南82-29’、‘云南蠻耗4 號(hào)’、‘大野’、‘廣東55號(hào)’、‘廣東31 號(hào)’和‘開(kāi)遠(yuǎn)割手密’等共6 個(gè)，兩年平均發(fā)病率范圍為35.6%～43.1%；第4 類是‘云南82-14’、‘88-22’和‘老撾2 號(hào)’共3 個(gè)，兩年平均發(fā)病率范圍為63.0%～72.4%；第5 類是‘新臺(tái)糖22 號(hào)’、‘福建大野’、‘越南1號(hào)’和‘廣東81號(hào)’共4個(gè)，兩年平均發(fā)病率范圍為81.3%～95.0%。

圖3 28份參試甘蔗種質(zhì)的聚類分析Fig.3 The cluster result of 28 tested clones

3 討論

本試驗(yàn)采用針刺接種所得出黑穗病發(fā)生率普遍較高，所有材料的平均發(fā)病率為36.7%，對(duì)照品種‘新臺(tái)糖22號(hào)’的發(fā)病率達(dá)到81.3%。而熊國(guó)如等[16]和沈萬(wàn)寬等[17]結(jié)果顯示‘新臺(tái)糖22號(hào)’在浸漬接種方式下的黑穗病發(fā)病率分別為45%和40%，均明顯低于本試驗(yàn)。沈萬(wàn)寬等[12]研究表明同一品種于注射接種后黑穗病發(fā)病率明顯高于浸漬接種后的黑穗病發(fā)生率，其中‘新臺(tái)糖22號(hào)’在浸漬接種下的黑穗病發(fā)病率為57%，而在注射接種后發(fā)病率大到75%，與本試驗(yàn)中‘新臺(tái)糖22號(hào)’抗病反應(yīng)較接近。OLWENY 等[18]報(bào)道針刺接種方式較浸漬接種方式更能提高甘蔗黑穗病發(fā)生機(jī)率。針刺接種打破了蔗芽對(duì)致病菌的物理屏障，有利于黑穗病菌成功侵染蔗芽生長(zhǎng)點(diǎn)，因此該方式可能偏向于鑒定種質(zhì)對(duì)黑穗病菌的內(nèi)部抗性[19]。本試驗(yàn)比較了參試材料2年的IS和AUDPC值的相關(guān)性，結(jié)果表明兩者間高度相關(guān)。通過(guò)主成分分析也發(fā)現(xiàn)IS、AUDPC和sAUDPC也是高度重疊，第1主成分特征值的方差貢獻(xiàn)率達(dá)89.652%，因此在針刺接種方式下進(jìn)行抗黑穗病鑒定選用其中一個(gè)指標(biāo)即可以較好地評(píng)價(jià)種質(zhì)的抗黑穗病。在浸漬接種方式中，闕友雄等[20]和李毅杰等[21]報(bào)道IS和AUDPC的相關(guān)系數(shù)分別為0.987和0.990。因此在兩種不同接種方式下IS和AUDPC均極顯著高度相關(guān)。

本試驗(yàn)對(duì)19個(gè)割手密和6 個(gè)大莖野生種進(jìn)行抗黑穗病鑒定，結(jié)果表明割手密和大莖野生種的抗黑穗病均具有廣泛的變異，在選擇野生種質(zhì)進(jìn)行育種利用時(shí)不應(yīng)忽視其抗黑穗病性。本試驗(yàn)中采用了甘蔗黑穗病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程（GB/T 35874-2018）和系統(tǒng)聚類分析兩種方法對(duì)野生種質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，分別將參試材料分為5類和5級(jí)，各級(jí)材料的黑穗病發(fā)病率分布范圍存在較大差異。GB/T 35874-2018 對(duì)4%～30%的發(fā)病區(qū)間細(xì)致劃分為R、MR和MS三級(jí)，而該區(qū)間在聚類分析中均劃分2類；聚類分析中將60%～100%的發(fā)病區(qū)間劃分為第4 和第5類，而在GB/T 35874-2018 將該區(qū)間定義于HS。造成差異的原因可能是GB/T 35874-2018 多用于浸漬接種后抗病評(píng)價(jià)，參試材料的發(fā)病率可能較多分布于4%～30%區(qū)間，因此在此區(qū)間多劃分等級(jí)有利于區(qū)別材料間的抗病反應(yīng)差異。本試驗(yàn)采用針刺接種，材料的發(fā)病率較高，因而在對(duì)高發(fā)病區(qū)間多劃分等級(jí)，實(shí)際工作中應(yīng)該結(jié)合兩種方法綜合考量。

4 結(jié)論

通過(guò)針刺接種新宿試驗(yàn)，從25 份甘蔗野生種質(zhì)中鑒定和篩選出3 份高抗種質(zhì)，其中割手密2 份，分別為‘云農(nóng)大2015-83’和‘云南83-1-81’；大莖野生種1份，為‘NG77-004’。這為甘蔗黑穗病抗性改良提供了優(yōu)良親本。此外，鑒定篩選出的高抗種質(zhì)也可作為抗黑穗病供體來(lái)挖掘優(yōu)良抗性基因，為將來(lái)抗黑穗病分子育種提供材料來(lái)源。