吳偉懷，劉寶慧，鹿鵬鵬，梁艷瓊，賀春萍，李銳，易克賢

（1.中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所/農業(yè)農村部熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室，?？?571101；2.南京農業(yè)大學植物保護學院，南京 210095；3.海南大學植物保護學院，?？?570228）

0 引言

由黑頂柄銹菌（Puccinia melanocephalaSydow）引起的甘蔗褐銹病是甘蔗生產中較為嚴重的病害之一[1]。該病主要為害葉片，起初病斑為淡黃色小斑點，并伴有黃色暈圈，后期病斑擴大，顏色變?yōu)樯詈稚?。夏孢子堆為紅褐色，大多數著生在葉背面，嚴重時，葉正面也可見紅褐色孢子堆。受害后的甘蔗分蘗減少，蔗莖變細[2]。在我國，甘蔗銹病在云南、四川、江西、福建和廣東等甘蔗產區(qū)發(fā)生，一般減產15%～30%，嚴重時可達40%以上，使得蔗糖含量下降10%～36%[3]。過去，該病害的鑒定主要依賴常規(guī)的形態(tài)學并結合傳統(tǒng)的鑒別寄主法。該方法需經過病原菌的分離（獲得）—形態(tài)鑒定—回接與再分離等過程，整個過程費時費力，還需要具備專業(yè)的分類學知識以及豐富的經驗。即使如此，其結果的準確性和可信度易受外界因素的影響，難以滿足快速、高通量鑒定與檢測的實際需求。顯然，依靠上述方法是無法對甘蔗褐銹病早期發(fā)生情況進行快速準確鑒定。所以有必要對甘蔗褐銹病菌的檢測與監(jiān)測技術做進一步的研究。

由巢式PCR（Nested PCR）基礎上改進而來的單管巢式PCR（Single-tube nested PCR），其具體原理是在同一個PCR 管中加入兩對引物（外引物、內引物對）以完成兩輪PCR 擴增；擴增所需反應液組分與普通PCR 的一樣，只是在擴增時外引物的退火溫度要高于內引物對的退火溫度約10 ℃。這樣在第一輪外引物擴增時，而此溫度下內引物不能結合；隨后第二輪內引物擴增以第一輪擴增反應產物為模板，內引物在較低退火溫度擴增時，此時外引物則因消耗完（控制外引物量）而不能進行有效擴增[4]。與巢氏PCR相比，單管巢氏PCR由于試驗過程中不需要開PCR 管操作，從而降低了污染的風險[4]。目前該技術已在梨火疫病病原菌（Erwinia amylovora）[5]、母羊胎兒組織弓形蟲（Toxoplasma gondii）[6]、貓屎胎三毛滴蟲（Tritrichomonas foetus）[7]、霍亂弧菌（Vibrio cholerae）[8]、谷物樣品鐮刀病菌（Fusarium culmorum）[9]、菠蘿凋萎病（Pineapple mealybug wilt）[10]、內臟利什曼病（Visceral leishmaniasis）[11]、濃毒癥（Pythiosis）[12]、結核性腦膜炎（Tuberculous meningitis）[13]、人類瘧原蟲（Human plasmodium）[14]等病原物檢測中得以應用。目前，針對甘蔗褐銹菌雖已建立了該病原菌的常規(guī)PCR[15-16]以及巢式PCR分子檢測方法[17]，但是關于該病原菌的單管巢式PCR的檢測體系尚未建立。為此，本文擬建立甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR檢測體系，為該病原菌的鑒定與檢測提供一種可靠的分子診斷技術。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究供試樣品DNA 共計16份，分別為甘蔗褐銹病菌（P.melanocephala）、甘蔗黃銹病菌（P.kuehnii）、咖啡駝孢銹菌（Hemileia vastatrix）、橡膠炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、咖啡褐斑病菌（Cercospora coffeicola）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）各2 份，以及甘蔗黑穗病菌（Sporisorium scitamineum）、劍麻莖腐病菌（Aspergillus niger）、雞蛋花鞘銹菌（Coleosporium plumierae）、葡萄層銹病菌（Phakopsora ampelopsidis）各1份（表1）。

表1 供試菌株Table 1 Strains used in this study

其中甘蔗褐銹病菌Pm1與Pm2，經提取核酸后檢測與克隆測序確認為甘蔗褐銹病菌后，作為本試驗的陽性樣品；而來自甘蔗褐銹病菌Pm1 菌株的ITS 質粒DNA 則作為靈敏度分析的DNA 模板；而其余甘蔗黃銹病菌、雞蛋花鞘銹菌、橡膠炭疽病菌、咖啡褐斑病菌、稻瘟病菌、劍麻莖腐病菌、甘蔗黑穗病菌樣品、葡萄層銹病菌等DNA 樣品一起作為特異性分析模板。所有菌株DNA 樣品均保存于中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所。

1.2 方法

1.2.1 基因組總DNA提取

甘蔗褐銹病菌DNA 的提取方法采用CTAB法提取[18]；其他供試菌株的DNA 提取均采用真菌DNA 提取試劑盒（E.Z.N.ATM Fungal DNA kit，Omega公司，美國）提取，具體實驗步驟按試劑盒的參考說明書進行。

1.2.2 甘蔗褐銹病菌ITS重組質粒的構建

利用WHITE等設計的引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）[19]對甘蔗褐銹病菌基因組DNA 進行擴增。反應體系為20 μL∶dd H2O 14.3 μL，10×rTaqBuffer 2 μL，2.5 mmol/L d NTPs 1.6 μL，rTaqDNA Polymerase 0.1 μL，10 μmol/L 的上下引物各0.5 μL，30 ng/μL 模板DNA 1 μL。PCR擴增程序為：94 ℃下預變性3 min，然后94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，34個循環(huán)后72 ℃延伸4 min，結束后保存于12 ℃。將擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收。取2 μL PCR 回收產物與pEASY-T1連接，并轉化到大腸桿菌培養(yǎng)（E.colitrans T1），經菌落PCR鑒定為陽性克隆后，用OMEGA 質粒提取試劑盒提取構建的重組質粒DNA，委托英濰捷基（上海）貿易有限公司廣州實驗室進行測序。

1.2.3 引物設計

通過下載與甘蔗褐銹病菌ITS 序列同源性比較高的相關序列，比對獲得甘蔗褐銹病菌ITS 序列的保守區(qū)域?；趩喂艹彩絇CR 擴增引物設計原理：一般外引物退火溫度高于內引物10 ℃左右，以所獲得Pm1 菌株ITS 序列為參考，利用Primer explorer 5.0 在線軟件針對多態(tài)性豐富特異性區(qū)域設計引物，設計好的引物委托英濰捷基（上海）貿易有限公司廣州合成部合成。

1.2.4 外引物與內引物最佳退火溫度篩選

為了確認甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 最佳的退火溫度，對所設計的內引物進行52～66 ℃梯度退火溫度擴增，篩選出最佳退火溫度；在內引物最佳退火溫度的基礎上，對外引物設置61～73 ℃梯度退火溫度，從中篩選出高于內引物最佳退火溫度大約10 ℃的外引物最佳退火溫度。

上述擴增均采用20 μL 反應體系，其具體程序與參數同1.2.2。內引物的反應程序為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，梯度退火溫度52～66 ℃10 s，72 ℃延伸25 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸4 min，12 ℃保存。外引物的反應程序為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，梯度退火溫度61～73 ℃10 s，72 ℃延伸25 s，35 個循環(huán)，72 ℃延伸4 min，12℃保存。

1.2.5 外引物與內引物最佳濃度比篩選

單管巢式PCR 正常運轉的第二個條件即為：通過外引物與內引物量的不同而到達控制外引物擴增。具體而言，在第一輪擴增中（外引物擴增）引物消耗殆盡后，內引物則以外引物產生的模板進行第二輪擴增。為此，以篩選出的外、內最佳退火溫度為基礎，設置外引物為1 nmol/L、10 pmol/L、0.1 pmol/L、10 fmol/L、1 fmol/L、0.1 fmol/L 6個不同的濃度，內引物設置為10 μmol/L，交叉組合進行單管巢式PCR濃度比試驗。

1.2.6 特異性分析及驗證

選取甘蔗褐銹病菌、甘蔗黃銹病菌、咖啡駝孢銹菌、橡膠炭疽病菌、咖啡褐斑病菌、稻瘟病菌菌株各2 株，以及雞蛋花鞘銹菌、葡萄層銹菌、甘蔗黑穗病菌、劍麻莖腐病菌株各1株，以上述16份菌株DNA為模板，并以dd H2O 為陰性對照。對所建立的甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 檢測體系進行特異性分析。PCR 反應體系以及反應程序以1.2.4和1.2.5最終確定的條件為準。

選用EcoRI酶對PCR產物進行酶切驗證。酶切體系（20 μL）：10×Quick CutBuffer2 μL、PCR產物8 μL、EcoRI 1.5 μL、dd H2O 8.5 μL。酶切程序：37 ℃3 h 30 min，65 ℃30 min。酶切產物用2%的瓊脂凝膠電泳檢測。

1.2.7 靈敏度分析

利用超微量分光光度計（NanoDrop 2000c）將質粒DNA 初始濃度調整為10 ng/μL，采用梯度稀釋法對DNA 進行100～10-6倍的稀釋，以dd H2O 為陰性對照，進行PCR 檢測。采用優(yōu)化后的甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 檢測體系，進行靈敏度分析。并利用PmF2/R2 進行普通PCR 靈敏度檢測，反應體系及反應程序參考1.2.4和1.2.5。

1.2.8 田間疑似病樣采集與DNA提取

從廣東湛江農墾東方紅農場甘蔗地收集疑似甘蔗褐銹病病葉，采用CTAB 法提取葉片總DNA，以進行單管巢式PCR檢測鑒定。

2 結果與分析

2.1 甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR的引物設計

將甘蔗褐銹病菌ITS 序列與下載自NCBI 數據庫中包括銹菌目10 個科14 個屬的24 條同源序列通過DNAStar 軟件以及在MultAlin 網站上（http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin.html）進行多重比對。結果表明，甘蔗褐銹病菌ITS 序列與其它菌株序列存在差異區(qū)域，最終根據差異區(qū)域設計了外引物對PmF1/R1 與內引物對PmF2/R2，二者預期擴增片段大小分別為433 bp、266 bp（表2）。

表2 甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 引物Table 2 Single-tube nested PCR primers for P.melanocephala

2.2 內引物與外引物的最佳退火溫度

根據已合成引物的預期退火溫度，將內引物對PmF2/R2設置為52～66 ℃8 個梯度退火溫度進行PCR 擴增。結果表明，在供試的8 個退火溫度中，內引物PmF2/R2 在退火溫度為52～57.3 ℃時，均能擴增出特異目的條帶；退火溫度為60.5 ℃時未擴增出特異性目的條帶。因此，內引物的最高退火溫度為57.3 ℃。據此，選取52 ℃作為內引物的最佳退火溫度，開展后續(xù)試驗（圖1）。

圖1 甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR內引物最佳退火溫度優(yōu)化Fig.1 Optimization of annealing temperature for internal single-tube nested primers for P.melanocephala

同理，根據已合成引物的預期退火溫度，將外引物設置為61～73 ℃8 個梯度退火溫度進行PCR 擴增，結果發(fā)現(xiàn)只有退火溫度為61～63.4 ℃時能擴增出清晰且特異條帶，退火溫度為65.5 ℃時，所擴增出的條帶較微弱，而其余4 個退火溫度均未出現(xiàn)目的條帶（圖2）。而內引物在退火溫度60.5 ℃及其以上時，并不能有效擴增。換言之，只有外引物退火溫度為60.5 ℃及以上時，方可到達單管巢式PCR 中外引物有效擴增。當退火溫度為63.4 ℃，條帶最為清晰，所以，選取63 ℃作為外引物的最佳退火溫度。

圖2 甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR外引物最佳退火溫度優(yōu)化Fig.2 Annealing temperature of single-tube nested PCR outer-primers for P.melanocephala

2.3 單管巢式PCR檢測體系外、內引物最佳濃度比

通過設置外引物為1 nmol/L、10 pmol/L、0.1 pmol/L、10 fmol/L、1 fmol/L、0.1 fmol/L 6個濃度梯度，將內引物濃度設為10 μmol/L，篩選可進行單管巢式PCR 外引物的有效量。試驗結果表明，供試的6 個不同外內引物濃度比中，均能擴增出相應的目的條帶（圖3）。從清晰度角度考慮，當引物濃度為10 pmol/L 時，肉眼可見條帶最為清晰明亮，所以將外引物的最佳濃度定位10 pmol/L。因此，外內引物的最佳終濃度比為0.5 pmol/L∶0.5 μmol/L。

圖3 甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR外內引物最佳濃度篩選Fig.3 Screening of optimal concentration of outer and inner primers for single tube nested PCR for P.melanocephala

2.4 單管巢式PCR檢測體系特異性分析

利用所建立的甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 檢測體系，對2份甘蔗褐銹病菌，以及14份其它非甘蔗褐銹病菌株DNA 進行擴增，并對PCR 產物進行酶切驗證其真實性。試驗結果表明，只有DNA 模板為甘蔗褐銹病菌時，可產生肉眼可見的清晰且特異的目的條帶，而其它14 株非甘蔗褐銹病菌DNA 均未擴增出目的條帶（圖4）。同時，擴增出的甘蔗褐銹病菌PCR 產物進行EcoRI酶切驗證，其酶切產物電泳出112 bp清晰條帶（圖5）。由此表明，所建立的甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR檢測體系具有高度的特異性。

圖4 甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR特異性分析Fig.4 Specificity analysis of single-tube nested PCR for P.melanocephala

圖5 甘蔗褐銹病菌PCR產物酶切Fig.5 PCR product digestion of P.melanocephala

2.5 靈敏度效果分析

單管巢式PCR 靈敏度結果顯示，在供試的8 個模板濃度中，前7 個模板的擴增條帶強弱隨其濃度的降低而依次變弱。當質粒模板濃度為10 fg/μL時，檢測出的目的條帶最弱；而當質粒模板濃度大于10 fg/μL時，則檢測不出目的條帶。由此表明，所建立的甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 檢測體系的最低檢測濃度為10 fg/μL（圖6A）。比較而言，普通PCR 的最低檢測濃度為10 pg/μL（圖6B）。所以，本試驗所開發(fā)的甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR反應體系的最低檢測終濃度（10 fg/μL）是常規(guī)PCR最低檢測終濃度（10 pg/μL）的1 000倍。

圖6 甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR靈敏度檢測Fig.6 Sensitivity detection of single-tube nested for P.melanocephala

2.6 田間疑似病樣分子鑒定

對田間采集的19 份疑似病樣進行了單管巢式PCR 檢測，檢測結果表明，其中18 份樣品經檢測均擴增出唯一條帶，其大小與預期的266 bp 一致。利用EcoRI 酶對18 份樣品PCR 產物進行酶切，酶切結果表明，所有樣品PCR 產物均可酶切出預期大小的目的條帶?？傊杉?9份疑似病樣經單管巢式PCR 檢測后，其中18份樣品DNA 中均含有甘蔗褐銹病菌（表3）。

表3 田間疑似病樣的分子檢測Table 3 Molecular detection of suspected disease samples in the field

3 討論與結論

隨著分子生物技術的不斷發(fā)展，許多技術用于病原微生物的分子檢測中。巢式PCR 檢測技術由于通過兩輪PCR 的擴增而大大提高了檢測的靈敏性，也正是通過第一輪擴增而產生的非特異性序列，由于不包含第二輪引物的擴增位點以致于其特異性也大大提高[4]。正因為巢式PCR 具有較好的特異性與靈敏度，已被廣泛應用。然而，巢式PCR 在以第一輪PCR產物作為模板擴增過程中其被潛在污染的風險也隨之增加。為此，基于巢式PCR改善而來的單管巢式PCR能很好地克服該缺點。

分子檢測技術得以廣泛應用的前提條件就是高質量的引物。換言之，開發(fā)出高度特異引物對是分子檢測技術賴以生存的首要條件[20-21]。為此，在本研究中通過對銹菌目10 個科14個屬的24 條ITS 序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)甘蔗褐銹病菌ITS區(qū)域與其它非甘蔗褐銹病菌存在一段特異區(qū)域?；谠撎禺愋詤^(qū)域，結合單管巢式PCR 引物設計原則中外引物對與內引物對退火溫度的要求，最終設計了單管巢式PCR 嵌套式引物對PmF1/R1與PmF2/R2，二者退火溫度預期相差約15 ℃。這為甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 檢測技術的建立奠定了基礎。

單管巢式PCR 檢測技術得以運行的關鍵因素之一，即外引物的退火溫度必須高于內引物的退火溫度10 ℃以上[10]。為此，本試驗對設計的2對引物外引物與內引物的實際退火溫度進行了篩選。根據試驗結果，最終篩選出甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR分子檢測技術的外引物與內引物的退火溫度分別為63 ℃與52 ℃。

在單管巢式PCR 檢測中，外引物與內引物量的比例是建立該檢測體系的又一關鍵因素[4]。為此，本研究對外引物對PmF1/R1 與內引物PmF2/R2 對之間的比例進行了篩選與優(yōu)化。經試驗結果表明甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 檢測技術外引物與內引物的最佳比例為0.5 pmol/L∶0.5 μmol/L。盡管單管巢式PCR 檢測技術體系中外引物與內引物的比例是十分關鍵的，但是針對不同引物其最佳引物比例也是不同的。如母羊胎兒組織勾形蟲外內引物終濃度比例為0.01 μmol/L∶0.4 μmol/L[6]，谷物樣品鐮刀病菌外內引物終濃度比0.1 fmol/L∶1 pmol/L[9]，菠蘿凋萎病外內引物濃度比為2 pmol/L∶0.2 nmol/L[10]，貓屎胎三毛滴蟲外內引物濃度比為12.5 fmol/L∶0.25 pmol/L[7]?？偠灾瑔喂艹彩絇CR 檢測技術體系中外引物與內引物的比例是十分關鍵的，但針對不同引物，其最佳比例也不同。

本研究先后對建立的甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 檢測體系的特異性、靈敏度等方面進行了測定。特異性結果顯示：該檢測體系只能從含有甘蔗褐銹病菌的DNA 模板中檢測出目的條帶，其它非同屬不同種的模板DNA 沒有產生任何條帶，具有高度的特異性。靈敏度結果顯示，甘蔗褐銹病菌單管巢式的靈敏度可達10 fg/μL。這一結果與結核性腦膜炎單管巢氏的靈敏度（1 fg/μL）[13]、霍亂弧菌的靈敏度（1 fg/μL）[8]相當，但是要比菠蘿凋萎病菌單管巢氏的靈敏度（0.95 pg/μL）[10]、膿毒癥病原菌（Pythium insidiosum）單管巢氏的靈敏度（2.7 pg/μL）[12]均要靈敏。最后利用該檢測技術，對19 份疑似病樣進行了檢測，其中18份樣本DNA 中均檢測出甘蔗褐銹病菌。由此可見，本研究所建立的甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR 檢測體系具有高度的特異性、靈敏性以及實用性。