劉 盼，江良榮，黃榮裕，黃育民，王侯聰，鄭景生

（廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建廈門(mén)361102）

隨著生活水平提高，人們開(kāi)始注重營(yíng)養(yǎng)保健，對(duì)功能性大米尤其是種皮富含微量元素和花青素的紅米、紫米和黑米有更多需求。紅米有活血補(bǔ)血、消腫散淤、潤(rùn)膚止癢等功效，具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，在民間多被稱(chēng)為神仙米、補(bǔ)血米、長(zhǎng)壽米、藥米等。遺傳研究結(jié)果顯示，水稻的紅色種皮性狀大多數(shù)由1對(duì)顯性基因控制［1-3］，該基因位于第7號(hào)染色體上［3-7］。Sweeney 等［4］研究表明，Rc 基因編碼一個(gè)具有bHLH結(jié)構(gòu)的Myc類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，白米品種Rc基因的第6外顯子上有14bp的缺失，導(dǎo)致花青素?zé)o法合成而使種皮呈現(xiàn)白色。傳統(tǒng)的紅米品種株型差、產(chǎn)量低、口感不好，因此選育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的紅米品種引起育種者重視，并育成許多優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的紅米品種如贛晚秈33號(hào)［8］、高優(yōu)紅88［9］、南兩優(yōu)紅3號(hào)［10］等。然而，采用傳統(tǒng)育種技術(shù)培育紅米新品種時(shí)，如用回交方法難以在回交世代選擇到紅米種皮基因型雜合或純合的單株，在分離后代難以選出紅米種皮基因型純合的株系，降低育種效率。然而，分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)不受外界環(huán)境條件影響，而且有較高選擇準(zhǔn)確性和育種效率，因而受育種家重視。為快速、準(zhǔn)確選育紅米水稻新品種，提高育種效率，本研究應(yīng)用水稻第7號(hào)染色體上紅米品種和白米品種種皮的基因序列差異，設(shè)計(jì)可用于準(zhǔn)確鑒別水稻紅米種皮基因型、呈共顯性的分子標(biāo)記并進(jìn)行驗(yàn)證，為應(yīng)用分子標(biāo)記輔助快速、有效選育紅米水稻新品種提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 研究材料和田間種植

研究材料為前期引進(jìn)或保存的種質(zhì)資源 （表1）：紅米品種17個(gè)、白米品種7個(gè)和紫（黑）米品種6個(gè)及用白米品種蜀恢527和紅米品種培雜191雜交的部分F2分離群體單株，各材料均種植于廈門(mén)大學(xué)龍?；?。種植的株行距20 cm×20 cm，每行種8株，單本插植，田間管理與一般大田相同。成熟時(shí)各材料分別單株收獲，曬干后用糙米機(jī)脫殼后觀察糙米種皮顏色。

表1 不同水稻品種的種皮顏色及紅米種皮的分子標(biāo)記檢測(cè)分析

1.2 水稻紅色種皮基因的分子標(biāo)記設(shè)計(jì)

利用水稻7號(hào)染色體上的紅色種皮與白色種皮品種間的堿基序列差異，即白米種皮的第6外顯子缺失14bp，采用Vector NTI Advance 11軟件，設(shè)計(jì)3對(duì)可用于輔助選擇區(qū)分水稻紅色種皮性狀的共顯性分子標(biāo)記（表2），然后用表1中的30個(gè)不同種皮顏色的水稻品種及R527/培雜191組合的F2群體中隨機(jī)選擇已鑒定種皮顏色的部分單株，用于驗(yàn)證這3對(duì)紅米種皮分子標(biāo)記。

表2 水稻紅色種皮性狀的功能性特異性分子標(biāo)記引物

1.3 DNA提取

各材料取分蘗期的嫩葉于2 mL離心管中，帶回室內(nèi)冷藏于-20℃冰箱或冰柜，參照王珍等［13］的方法快速提取DNA。

1.4 PCR反應(yīng)體系和程序

PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序具體參考鄭景生等［14］的方法。

1.5 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增檢測(cè)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分離檢測(cè)采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用快速銀染法進(jìn)行染色，記錄各條帶的基因型后照相保存，具體參考鄭景生等［14］的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻紅色種皮性狀的分子標(biāo)記可準(zhǔn)確鑒定不同品種的種皮顏色

30個(gè)水稻品種稻谷脫殼后觀察其糙米種皮顏色，看出：編號(hào)為1-17的水稻品種種皮為紅色，編號(hào)為18-24的水稻品種種皮為白色，編號(hào)為25-30的水稻品種種皮為紫色或黑色（表1）。用本研究設(shè)計(jì)的水稻紅色種皮性狀的分子標(biāo)記HS-1、HS-2和HS-3對(duì)這30個(gè)水稻品種的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和凝膠電泳檢測(cè)（表1、圖1），結(jié)果表明：分子標(biāo)記HS-1、HS-2、HS-3均能擴(kuò)增出特異性條帶，紅米品種的條帶分別為193bp、106bp、131bp，非紅米品種（白米或紫米、黑米）的條帶分別為179bp、92bp、117bp。將各水稻品種的分子標(biāo)記DNA擴(kuò)增條帶結(jié)果與其糙米種皮顏色相比較，發(fā)現(xiàn)分子標(biāo)記HS-1、HS-2和HS-3對(duì)30個(gè)水稻品種的種皮顏色DNA鑒定結(jié)果與表型的鑒定結(jié)果相同?？梢?jiàn)，水稻紅色種皮性狀的分子標(biāo)記HS-1、HS-2和HS-3均可用于鑒定水稻紅米品種和非紅米品種。

圖1 紅米種皮分子標(biāo)記HS-1、HS-2和HS-3在不同水稻品種的電泳條帶

2.2 水稻紅色種皮性狀的分子標(biāo)記可準(zhǔn)確鑒定紅米品種雜交后代分離群體單株的種皮顏色

為進(jìn)一步驗(yàn)證水稻紅色種皮選擇的分子標(biāo)記HS-1、HS-2、HS-3是否能準(zhǔn)確鑒定紅米品種雜交后代群體單株的糙米種皮顏色，從白米品種R527與紅米品種培雜191 的雜交后代（F2）分離群體中，隨機(jī)選取種皮的顏色已經(jīng)鑒別的部分單株的DNA用于PCR擴(kuò)增、凝膠電泳檢測(cè)，圖2結(jié)果看出：HS-1、HS-2、HS-3對(duì)R527/培雜191 F2代分離群體單株均能擴(kuò)增出3種不同基因型的條帶，即基因純合顯性的紅米、基因純合隱性的非紅米及基因雜合型的紅米，各單株糙米種皮顏色的DNA鑒定結(jié)果與其表型相吻合。說(shuō)明水稻紅色種皮性狀的分子標(biāo)記HS-1、HS-2和HS-3均可準(zhǔn)確鑒定紅米雜交后代群體中各單株的糙米種皮顏色基因型，可快速準(zhǔn)確選擇出紅米種皮基因型純合的單株。

圖2 分子標(biāo)記HS-1、HS-2和HS-3在R527/培雜191 F2群體的部分單株電泳條帶

由此可見(jiàn)，水稻紅色種皮性狀的分子標(biāo)記HS-1、HS-2和HS-3都可以準(zhǔn)確鑒定水稻紅色種皮性狀，快速?gòu)碾s交后代群體中篩選出紅米種皮基因型純合的株系。但從這3對(duì)標(biāo)記的PCR擴(kuò)增穩(wěn)定性、擴(kuò)增產(chǎn)物電泳所需時(shí)間和電泳條帶清晰度進(jìn)行綜合分析看出，HS-2具有擴(kuò)增穩(wěn)定、條帶清晰、條帶間差異最明顯、引物片段小、電泳時(shí)間短的特點(diǎn)。綜上，研究認(rèn)為，HS-2是分子標(biāo)記輔助選育水稻紅米品種較為可靠的標(biāo)記引物，可提高選育紅米品種的效率。

3 討論

分子標(biāo)記輔助選育已成為當(dāng)前選育作物新品種的一項(xiàng)重要技術(shù)，它在分子水平上對(duì)目標(biāo)性狀的選擇不受其它基因或環(huán)境條件的影響，可避免等位基因間的顯隱性關(guān)系干擾，選擇結(jié)果很可靠，且可在育種的早世代完成，尤其是對(duì)感官難以鑒別的性狀，如抗病、食味品質(zhì)、香味等具有較高的選擇效率，從而大大縮短育種周期。目前該技術(shù)已在水稻抗病蟲(chóng)［15-17］的目標(biāo)性狀選擇取得良好效果。紅米具有重要的營(yíng)養(yǎng)保健功能而受到人們重視，為加快紅米育種效率，魏文嵩等［11］、張亭亭等［12］設(shè)計(jì)出可對(duì)紅米品種進(jìn)行分子標(biāo)記選擇的引物，有利提高紅米品種的育種效率。

本研究基于水稻第7號(hào)染色體上紅米與非紅米種皮基因序列差異，即白米品種第6外顯子缺失14bp，設(shè)計(jì)出3對(duì)水稻紅色種皮分子標(biāo)記HS-1、HS-2和HS-3（表2），這3對(duì)標(biāo)記可準(zhǔn)確鑒定紅米和非紅米水稻品種、準(zhǔn)確區(qū)分紅米雜交后代群體紅米種皮純合顯性、純合隱性和雜合基因型的植株，對(duì)有效選育紅米新品種具有很大幫助。其中，HS-2具有擴(kuò)增穩(wěn)定、條帶清晰、電泳時(shí)間短等特點(diǎn)而成為本研究推薦的MAS選擇紅米品種的首選分子標(biāo)記。