秦如冰，葉麗，尹嘉梁，張翔，文傳凇，王勇*

熱帶轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南省熱帶藥用植物研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院（?？?571199）

牛肝菌作為肉質(zhì)大型真菌而被開(kāi)發(fā)廣泛，暗褐脈柄牛肝菌作為其中的成員具有很好的開(kāi)發(fā)潛力。暗褐脈柄牛肝菌（Phlebopus portentosus），又名暗褐網(wǎng)柄牛肝菌、異樣脈柄牛肝菌，隸屬于擔(dān)子菌門(mén)（Basidionycota），傘菌綱（Aganicomycetes），牛肝菌目（Boletales），小牛肝菌科（Boletinellaceae），脈柄牛肝菌屬（Phlebopus），主要分布在我國(guó)云南、廣西和海南。暗褐脈柄牛肝菌個(gè)體肥大，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，是備受群眾喜愛(ài)的名貴食用菌[1]。近年來(lái)，圍繞多糖活性的研究，報(bào)道了很多多糖的功效[2-3]。Kamchantat等[4]利用水提醇沉法獲得多糖蛋白質(zhì)復(fù)合物，經(jīng)分離純化后，得到的多糖片段PPC-P11具有很強(qiáng)的抗氧化能力，并且在體外對(duì)5種人類(lèi)細(xì)胞株有相對(duì)強(qiáng)的抗擴(kuò)增能力，說(shuō)明暗褐網(wǎng)柄牛肝菌在抗腫瘤方面有一定的潛力，除此之外還有降低血糖的作用。

為進(jìn)一步研究暗褐脈柄牛肝菌子實(shí)體粗多糖，使其得到更為合理的開(kāi)發(fā)和利用，在單因素試驗(yàn)考察的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以子實(shí)體多糖提取率為考察指標(biāo)，進(jìn)一步優(yōu)化暗褐脈柄牛肝菌粗多糖的提取工藝，為后續(xù)暗褐脈柄牛肝菌子實(shí)體粗多糖的藥理活性試驗(yàn)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料

暗褐脈柄牛肝菌子實(shí)體采自云南西雙版納，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室曾念開(kāi)教授鑒定為暗褐脈柄牛肝菌（Phlebopus portentosus）的子實(shí)體，采集的子實(shí)體經(jīng)切片后烘干，粉碎后過(guò)0.425 mm（40目）篩至密封袋內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；氯仿、正丁醇、苯酚、濃硫酸（廣州化學(xué)試劑廠）。除葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品外其余試劑均為分析純。

1.1.3 儀器和設(shè)備

粉碎機(jī)（HC-150T2，永康市綠可食品機(jī)械有限公司）；新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（T6，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；恒溫水浴箱（HH-6，常州澳華儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA，上海亞榮生化儀器有限公司）；電子天平[AL-104，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 暗褐脈柄牛肝菌粗多糖提取率的測(cè)定

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱(chēng)取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，于105 ℃干燥至恒重，取適量加入少量蒸餾水使其溶解，定容于100 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度10 mg/mL葡萄糖儲(chǔ)備液。精密吸取1 mL儲(chǔ)備液定容至100 mL，配成0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

配制5%苯酚溶液：精確量取0.5 mL苯酚，加入蒸餾水定容至10 mL棕色容量瓶中。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別吸取0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液置于試管中，分別加水至2.0 mL，各加1 mL苯酚試液搖勻，迅速加入5 mL濃硫酸（與液面垂直加入，勿與管壁接觸，便于反應(yīng)液充分混合），振蕩混勻后，置于沸水浴中煮沸15 min，取出迅速冷卻至室溫（預(yù)先在冰箱制作冰塊，迅速放在冰塊里冷卻）；另以2.0 mL蒸餾水經(jīng)相同處理為空白對(duì)照，在490 nm處測(cè)定吸光度，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程可得A=0.685 7C-0.001 9，R2=0.999 5。

1.2.1.2 暗褐脈柄牛肝菌粗多糖的提取及提取率測(cè)定

稱(chēng)取2 g暗褐脈柄牛肝菌粉末，精密稱(chēng)定，置于錐形瓶?jī)?nèi)，加入超純水進(jìn)行水浴、過(guò)濾和萃取，以超純水定容至100 mL，取適量溶液，加入適量苯酚和濃硫酸[5]，在490 nm下測(cè)定溶液吸光度，依據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算暗褐脈柄牛肝菌粗多糖提取率。按式（1）計(jì)算。

式中：C為測(cè)得的多糖溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；V為多糖溶液測(cè)定體積，mL；N為樣品稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，mg[6-8]。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 液料比

取2 g共4份暗褐脈柄牛肝菌粉末，精密稱(chēng)定質(zhì)量，置于具塞錐形瓶，分別加入10，20，40和60 mL蒸餾水，置于80 ℃水浴鍋中，水浴提取80 min，提取結(jié)束，離心后加等量蒸餾水水浴，冷卻至室溫，合并2次提取液。取10 mL粗多糖溶液，加入10 mL氯仿-正丁醇（預(yù)先配制成體積比5∶1混合液）溶液，置于分液漏斗中，充分振搖靜置，去除中間變性蛋白層，將水相與有機(jī)相分離。將水相加入10 mL的氯仿-正丁醇溶液，重復(fù)上述過(guò)程，共計(jì)重復(fù)4次。取1 mL萃取液定容至100 mL容量瓶，從中取2 mL加入1 mL 5%苯酚溶液，搖勻，迅速加入5 mL濃硫酸，振搖，置沸水浴上加熱15 min，然后置冷水浴中冷卻至室溫，以純凈水經(jīng)相同處理為空白對(duì)照，在490 nm處用分光光度計(jì)測(cè)定提取液吸光度，計(jì)算多糖提取率，比較不同液料比對(duì)多糖提取率的影響。

1.2.2.2 浸提溫度

取2 g共4份暗褐脈柄牛肝菌粉末，精密稱(chēng)定質(zhì)量，置于具塞錐形瓶中，加入40 mL蒸餾水，分別在70，80，90和100 ℃條件下浸提80 min，按照1.2.2.1小節(jié)的方法處理，計(jì)算多糖提取率，比較不同浸提溫度對(duì)提取率的影響。

1.2.2.3 提取時(shí)間

取2 g共4份暗褐脈柄牛肝菌粉末，精密稱(chēng)定質(zhì)量，置于具塞錐形瓶中，每份分別加入40 mL蒸溜水，水浴提取溫度80 ℃，提取時(shí)間分別為40，60，80和100 min。按照1.2.2.1小節(jié)的方法處理，計(jì)算多糖提取率，比較不同提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響[9-10]。

2 結(jié)果與結(jié)論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對(duì)牛肝菌多糖提取率的影響

設(shè)定浸提溫度80 ℃、提取時(shí)間80 min，對(duì)液料比進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，液料比5∶1～20∶1 mL/g時(shí)，隨著液料比逐步增大，多糖提取率逐漸升高，液料比20∶1 mL/g時(shí)，提取率最大為15.45%。可能的原因是：適當(dāng)?shù)奶崛∪軇┯昧靠梢栽黾优８尉c水的接觸面積，有利于牛肝菌多糖的溶出[11]。液料比超過(guò)20∶1 mL/g時(shí)，多糖提取率有下降趨勢(shì)，可能是由于加入過(guò)多的溶劑會(huì)增加后續(xù)濃縮時(shí)間，造成多糖損失[12]。結(jié)合響應(yīng)面的優(yōu)化特點(diǎn)及實(shí)際考慮，液料比選擇20∶1 mL/g。

圖1 液料比對(duì)多糖提取率的影響

2.1.2 浸提溫度對(duì)牛肝菌多糖提取率的影響

設(shè)定液料比20∶1 mL/g、提取時(shí)間80 min，對(duì)浸提溫度進(jìn)行優(yōu)化。由圖2可知，隨著溫度不斷升高，提取率隨之升高，當(dāng)溫度超過(guò)適宜溫度時(shí)，提取率隨之下降，可能溫度過(guò)高容易造成多糖活性結(jié)構(gòu)等發(fā)生改變，多糖提取率大受影響，故溫度升高到80 ℃以后，多糖提取率下降[13-14]。最佳浸提溫度為80 ℃。

圖2 浸提溫度對(duì)多糖提取率的影響

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)牛肝菌多糖提取率的影響

設(shè)定液料比20∶1 mL/g、浸提溫度80 ℃，對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。由圖3可知，提取率隨提取時(shí)間增加而升高，80 min后提取率開(kāi)始下降[15-16]，結(jié)合響應(yīng)面的優(yōu)化特點(diǎn)及實(shí)際考慮，提取時(shí)間選擇80 min。

圖3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化暗褐脈柄牛肝菌粗多糖提取工藝

2.2.1 提取條件的優(yōu)化分析

在單因素試驗(yàn)優(yōu)化的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken Design（BBD）原理，選擇影響暗褐網(wǎng)柄牛肝菌粗多糖提取率（Y）的液料比（A）、浸提溫度（B）、提取時(shí)間（C）3個(gè)影響因素作為考察的變量，設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，確定暗褐網(wǎng)柄牛肝菌粗多糖最佳的提取工藝。響應(yīng)面試驗(yàn)因素及各因素水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。采用Design Expert對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面二次回歸擬合分析，得到回歸方程Y=15.85-0.028 7A+0.202 5B-0.038 8C-0.152 5AB+0.520 0AC-0.687 5BC-0.380 5A2-0.253 0B2-0.485 5C2?；貧w方程一次項(xiàng)中各項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度，系數(shù)的正負(fù)反映影響的方向[17]。

表1 Box-Behnken中心試驗(yàn)因素水平表

2.2.2 方差分析

由表3可知，該模型p＜0.01，證明此模型差異高度顯著，失擬項(xiàng)p=0.053 5＞0.05，表現(xiàn)為不顯著，說(shuō)明實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間無(wú)失擬存在，說(shuō)明該數(shù)字模型具有較好的預(yù)測(cè)性[18]?；貧w模型的R2=0.910 3，說(shuō)明該模型與實(shí)際結(jié)果擬合良好，試驗(yàn)方法可靠。對(duì)模型各項(xiàng)分析，二次項(xiàng)A2、C2影響顯著或高度顯著，交互項(xiàng)AC、BC差異顯著，表明液料比和提取時(shí)間，浸提溫度和提取時(shí)間相互作用關(guān)系較強(qiáng)。不難看出，一次項(xiàng)中對(duì)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖提取率的影響依次為浸提溫度＞提取時(shí)間＞液料比[19]。

表3 方差分析結(jié)果

2.2.3 交互因素分析

響應(yīng)面圖中越陡峭則顯示該因素對(duì)其影響越明顯，反之，越平坦則影響不明顯。等高線圖可以依據(jù)其圖形的形狀來(lái)判斷其交互影響的程度，若圖形為橢圓則交互現(xiàn)象越明顯，若圖形為圓形則交互現(xiàn)象不明顯[20]。從圖4可以看出，響應(yīng)曲面圖曲面彎曲程度大小順序是BC＞AC＞AB，浸提溫度與提取時(shí)間的響應(yīng)曲面最陡，其對(duì)應(yīng)的等高線圖的橢圓形扁平程度也最大，說(shuō)明浸提溫度與提取時(shí)間的交互作用最明顯。液料比和提取時(shí)間的響應(yīng)曲面坡度較大，等高線呈橢圓形，說(shuō)明對(duì)多糖的提取率影響較為顯著，液料比和浸提溫度交互作用等高線圖沒(méi)有呈現(xiàn)明顯的橢圓形，而是接近于圓形，說(shuō)明其交互作用不明顯，與回歸方程方差分析結(jié)果一致。

圖4 兩兩因素相互作用對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

應(yīng)用分析軟件Design-Expert 8.0.6.1，由RSM預(yù)測(cè)最優(yōu)值，優(yōu)化后的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖的提取條件為液料比20∶1 mL/g，浸提溫度78.72 ℃，提取時(shí)間77.76 min。為驗(yàn)證響應(yīng)面法優(yōu)化預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，根據(jù)試驗(yàn)可操作性對(duì)最佳提取工藝參數(shù)稍作調(diào)整：浸提溫度79 ℃，提取時(shí)間78 min，液料比20∶1 mL/g。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)（3個(gè)重復(fù)），結(jié)果顯示暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖平均提取率為15.95%，與預(yù)測(cè)值相近。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面法，對(duì)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響大小依次為浸提溫度＞提取時(shí)間＞液料比。建立多糖提取率的回歸模型，由該模型優(yōu)化的多糖提取條件為液料比20∶1 mL/g、浸提溫度78.72 ℃、提取時(shí)間77.76 min，多糖提取率為15.99%。在此條件下，對(duì)最佳提取工藝參數(shù)稍作調(diào)整：浸提溫度79 ℃，提取時(shí)間78 min，液料比20∶1 mL/g，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖提取率為15.95%，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果相近，說(shuō)明所建模型與采用的優(yōu)化方法可靠，適用于暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖的水提工藝優(yōu)化和分析[21-22]。