張麗娜，金鐵巖*，楊辛雅，郭玉媛，張智勇

延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院（延吉 133002）

在正常狀態(tài)下，機(jī)體的氧化和抗氧化之間處于平衡狀態(tài)，氧化應(yīng)激是病理狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激時(shí)，氧化和抗氧化的平衡狀態(tài)被打破，可能會(huì)導(dǎo)致過量的自由基積累，過量自由基會(huì)對(duì)機(jī)體內(nèi)的DNA等生物大分子造成損傷作用，最終對(duì)機(jī)體造成損害，并引發(fā)一系列的并發(fā)癥[1-2]。同時(shí)，癌癥是世界上第二大死亡原因，對(duì)人類的健康和生命有著嚴(yán)重威脅[3]。近年來，越來越多研究關(guān)注天然植物食品在抗癌活性方面的作用[4]，逐漸成為研究熱點(diǎn)。研究并開發(fā)具有天然良好抗氧化、抗癌活性的天然物質(zhì)對(duì)醫(yī)藥及保健領(lǐng)域而言十分重要。

猴頭菇（Hericium erinaceus）屬于擔(dān)子菌門、層菌綱、非褶菌目、猴頭菇屬[5]，是腐生菌的一種。野生猴頭菇大部分生長(zhǎng)在東北的大興安嶺和西北的天山等地區(qū)。猴頭菇作為高等真菌，自古以來受到人們的重視和喜愛，其含有多種營(yíng)養(yǎng)成分、多種維生素和微量元素[6]，并且猴頭菇有很好的藥效作用，可用于治療消化不良、胃潰瘍、胃炎等消化系統(tǒng)疾病。近些年國(guó)外的研究發(fā)現(xiàn)，猴頭菇中含有豐富的多酚以及黃酮類物質(zhì)[7-8]，具有清除自由基[9]、消炎[10]、抗菌[11-13]、殺死癌細(xì)胞[14]等活性。近年來，在猴頭菇功能性成分的研究中，猴頭菇多糖對(duì)胃的保護(hù)作用[15]最受到關(guān)注，關(guān)于其提取物抗氧化性和抗癌性方面的相關(guān)研究相對(duì)較少，因此，試驗(yàn)對(duì)猴頭菇的一般成分和功能性成分進(jìn)行測(cè)定，用乙醇和熱水提取猴頭菇，并對(duì)猴頭菇提取物的抗氧化活性和抗癌活性進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果將為猴頭菇的綜合開發(fā)應(yīng)用提供理論數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

猴頭菇：采摘自黑龍江省海林市。

人肝癌細(xì)胞（HepG2）、人結(jié)腸癌細(xì)胞（HT29）：購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

95%乙醇（分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）；蘆丁（色譜純，上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司）；沒食子酸（色譜純，上海源葉生物科技有限公司）；DPPH標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純，上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司）；抗壞血酸（VC，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；ABTS溶液（分析純，上海源葉生物科技有限公司）；過氧化氫（分析純，廈門安永博科技有限公司）；RPM1-1640培養(yǎng)基（上海源葉生物科技有限公司）；DMED培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司）；MTT試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；Hoechst33258熒光染色劑（北京百奧萊博生物科技有限公司）；細(xì)胞凋亡試劑盒（武漢普諾賽生命科技有限公司）；胎牛血清、胰蛋白酶，碘化丙啶（PI）、5-氟胞嘧啶、苦參堿（上海源葉生物科技有限公司）。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

U-3900紫外可見分光光度計(jì)（日立天美司）；QFST-250SQ索式提取儀（浙江普托儀器有限公司）；KDN-08A凱式定氮儀（上海明嘉電子有限公司）；MA45紅外水分測(cè)定儀（深圳市分析儀器制造有限公司）；BS223S電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；GHP-9080N恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SHA-C水浴恒溫振蕩器（常州市華普達(dá)儀器有限公司）；Sergy酶標(biāo)儀（深圳市愛康科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 猴頭菇一般成分的測(cè)定

參照GB 5009.3—2016[16]的直接干燥法測(cè)定水分含量，參照GB 5009.4—2016[17]第一法來測(cè)定粗灰分含量，參照GB 5009.5—2016[18]凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白質(zhì)含量，參照GB 5009.6—2016[19]索氏抽提法測(cè)定粗脂肪含量，碳水化合物含量為100%中減去水分含量、粗灰分含量、粗蛋白含量和粗脂肪含量。

1.2.2 猴頭菇提取物制備

將干燥的猴頭菇粉碎后分別用80%乙醇和熱水提取。料液比為1∶10 g/mL。使用90 ℃熱水提取120 min。在25 ℃下使用乙醇提取38 h。試驗(yàn)步驟重復(fù)3次并把濾液進(jìn)行合并，后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中直至原體積1/10，后使用冷凍干燥機(jī)凍干，分別得到猴頭菇乙醇提取物和猴頭菇熱水提取物。放入-20 ℃的冰箱中備用。

1.2.3 總酚含量的測(cè)定

總酚含量（TPC）測(cè)定參照文獻(xiàn)[20]。

1.2.4 總黃酮含量的測(cè)定

總黃酮含量（TFC）測(cè)定參照文獻(xiàn)[21]。

1.2.5 DPPH·清除活性的測(cè)定

采用文獻(xiàn)[22-23]的方法進(jìn)行測(cè)定，DPPH清除率按式（1）計(jì)算。

式中：R為DPPH清除率，%；A1為試驗(yàn)組的吸光度；A2為樣品組的吸光度；A3為空白組的吸光度。

1.2.6 ABTS+·清除活性的測(cè)定

采用文獻(xiàn)[22-23]的方法進(jìn)行測(cè)定。ABTS清除率按式（2）計(jì)算。

式中：R為ABTS+清除率，%；A0為試驗(yàn)組的吸光度；A1為樣品組的吸光度。

1.2.7 ·OH-清除活性的測(cè)定

采用文獻(xiàn)[22-23]的方法進(jìn)行測(cè)定。將1.0 mL 1.865 mmol/L鄰二氮菲的無水乙醇溶液以及1.0 mL 1.865 mmol/L的FeSO4·7 H2O溶液、2 mL 0.2 mmol/L磷酸鹽緩沖液以及1 mL的0.03%過氧化氫先后加入具塞試管中并充分混合均勻，置于密封狀態(tài)下進(jìn)行恒溫水浴反應(yīng)，溫度為37 ℃，時(shí)間為1 h，隨后用紫色分光光度計(jì)測(cè)其536 nm處的吸光度，OH-自由基清除率按式（3）計(jì)算。

式中：R為OH-清除率，%；A0為空白組的吸光度；A1為試驗(yàn)組的吸光度；A2為損傷組的吸光度。

1.2.8 猴頭菇提取物的抗癌活性測(cè)定

首先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，將HepG2、HT29細(xì)胞接種于含有10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基上，后放置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為48 h，溫度為37 ℃，CO2含量為5%。試驗(yàn)使用MTT法測(cè)定猴頭菇提取物的抗癌活性，使用0.25%胰酶消化培養(yǎng)好的癌細(xì)胞，使其成為1×104cells/mL的細(xì)胞懸液，接種在96孔板中并加入不同濃度的猴頭菇提取液，使其充分反應(yīng)，72 h后，加入MTT溶液并放入恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)4 h后將DMSO加入其中，隨后為使晶體充分溶解，使用搖床低速振蕩，時(shí)間為10 min。在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度。HepG2 細(xì)胞試驗(yàn)、HT29細(xì)胞試驗(yàn)分別使用5-氟胞嘧啶（5-FU），用苦參堿（Mat）作為陽性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 猴頭菇粉末中的一般成分含量

由表1可知，其中水分含量8.40%±0.01%，粗灰分含量7.37%±0.01%，粗脂肪含量3.15%±0.02%，粗蛋白含量24.52%±0.01%，碳水化合物含量56.56%±0.02%。將猴頭菇的粗灰分、粗脂肪、粗蛋白含量與于士軍等[24]對(duì)四種食用菌（金針菇、猴頭菇、香菇）的營(yíng)養(yǎng)成分分析進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，與其他三種食用菌相比，猴頭菇中粗脂肪、粗蛋白、粗灰分含量均相對(duì)較高。

表1 猴頭菇一般成分含量 單位：%

2.2 總酚及總黃酮含量測(cè)定

有研究[25-26]指出，酚類化合物是所有自然產(chǎn)物中的主要抗氧化活性成分，它廣泛存在于綠色植物中，并可能是植物提取物中的主要抗氧化劑。而根據(jù)表2所顯示，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.089 3x+0.011 1（R2=0.999 8），蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.082 6x+0.006 7（R2=0.999 8）。根據(jù)方程計(jì)算得猴頭菇粉末中的總酚和總黃酮含量分別為3.43×105μg/kg和3.0×105μg/kg。

表2 猴頭菇中總酚和總黃酮含量

2.3 DPPH·清除活性

DPPH·是一個(gè)穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，DPPH·已經(jīng)被廣泛地使用作為反應(yīng)樣品抗氧化的能力的方式[27]。猴頭菇不同提取物對(duì)DPPH清除率結(jié)果如圖1所示。隨著提取物濃度的增加，其對(duì)DPPH自由基的清除率隨之升高，濃度和清除率之間有著量效關(guān)系。在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，除提取物質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL外，熱水、乙醇、VC三者對(duì)DPPH自由基的清除率存在顯著差異（p＜0.05）。當(dāng)提取物質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，乙醇提取物和熱水提取物的清除能力相近，清除率分為63.4%和58.1%，兩者之間無顯著差異（p＞0.05）。在此之后隨著樣液濃度的增加，乙醇提取物始終保持比熱水提取物更優(yōu)的清除效果，且兩者的清除能力產(chǎn)生明顯差距，最終兩者清除率分別達(dá)到94.1%和85.1%，均處于較高水平。

圖1 猴頭菇提取物DPPH自由基清除率

2.4 ABTS+·清除活性

如圖2所示，隨著樣品濃度的逐漸升高，猴頭菇乙醇提取物、熱水提取物對(duì)ABTS自由基的清除能力均隨樣品濃度的升高而增大，且都表現(xiàn)出了明顯的對(duì)ABTS的清除能力。在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，猴頭菇乙醇提取物清除率始終高于熱水提取物。在較低質(zhì)量濃度（0.10～0.05 mg/mL）時(shí)，乙醇提取物和熱水提取物對(duì)ABTS的清除能力差異并不顯著（p＞0.05），在較高質(zhì)量濃度（1.00～3.00 mg/mL）時(shí)，乙醇提取物、熱水提取物與陽性對(duì)照之間存在顯著差異（p＜0.05），在質(zhì)量濃度為3.00 mg/mL時(shí)，兩者清除率分別達(dá)到73.5%和67.8%。在相同質(zhì)量濃度下，抗壞血酸對(duì)ABTS自由基的清除能力始終為最高水平，熱水提取物始終為最低水平。

圖2 猴頭菇提取物ABTS自由基清除率

2.5 ·OH-清除

如圖3所示，猴頭菇提取物均對(duì)OH-有一定的清除能力，且隨著樣液濃度的增加而升高，即與樣液濃度之間有一定的量效關(guān)系。在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，猴頭菇乙醇提取物OH-的清除能力始終強(qiáng)于熱水提取物，在質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，乙醇提取物對(duì)OH-的清除能力與抗壞血酸十分接近，兩者沒有顯著性差異（p＞0.05）。在質(zhì)量濃度范圍為1.00～3.00 mg/mL時(shí)，乙醇提取物、熱水提取物與陽性對(duì)照之間存在顯著差異（p＜0.05），抗壞血酸OH-清除能力始終為最高水平。當(dāng)猴頭菇提取物質(zhì)量濃度為3.00 mg/mL時(shí)，抗壞血酸、乙醇提取物、熱水提取物對(duì)OH-清除率分別為54.9%，46.1%和41.7%，均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的OH-清除能力。綜合來看，抗壞血酸OH-清除能力最優(yōu)，乙醇提取物第二，熱水提取物第三。

圖3 猴頭菇提取物OH-清除率

2.6 猴頭菇提取物抗癌能力評(píng)價(jià)

如圖4所示，猴頭菇提取物對(duì)于HepG2的抑制效果都有良好表現(xiàn)，而且兩種溶劑提取物的抑制效果都隨著樣液濃度的升高而升高，有劑量依賴性。在樣液質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，乙醇提取物與5-FU的抑制率非常接近，兩者之間沒有顯著性差異（p＞0.05），且其抑制率顯著優(yōu)于熱水提取物（p＜0.05），當(dāng)樣液質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL時(shí)，乙醇提取物和熱水提取物的抑制率之間沒有顯著性差異（p＞0.05），當(dāng)樣液質(zhì)量濃度達(dá)到2.00 mg/mL時(shí)，兩者之間重新表現(xiàn)出顯著的差異（p＜0.05）。從整體上看，乙醇提取物對(duì)于HepG2細(xì)胞的抑制效果比熱水提取物的抑制效果更好。

圖4 猴頭菇提取物對(duì)HepG2的抑制率

如圖5所示，在提取物質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí)，乙醇提取物對(duì)HT29的抑制效果優(yōu)于熱水提取物的抑制效果，但當(dāng)樣液質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，熱水提取物的抑制效果超過了乙醇提取物的抑制效果，且與Mat的抑制率接近，乙醇提取物和熱水提取物之間沒有顯著性差異（p＞0.05）。隨著后續(xù)濃度逐漸升高，乙醇提取物重新表現(xiàn)出優(yōu)于熱水提取物的效果。整體來看，熱水提取物和乙醇提取物的抑制效果均是隨著提取物濃度的升高而表現(xiàn)得更好，但是增長(zhǎng)幅度逐漸趨于平穩(wěn)。從整體上看，對(duì)于HT29細(xì)胞的抑制效果，乙醇提取物要比熱水提取物好。

圖5 猴頭菇提取物對(duì)HT29的抑制率

3 結(jié)論

猴頭菇提取物對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基和羥基自由基都有良好的自由基清除能力。在兩種提取物中，乙醇提取物的抗氧化能力更好，這一結(jié)果可能與提取物中酚類物質(zhì)的含量、種類和組成比例有關(guān)。猴頭菇提取物同時(shí)表現(xiàn)出了良好的抗癌活性?？拱┬耘c提取物濃度呈明顯的量效關(guān)系。除熱水提取物在抑制HT29細(xì)胞試驗(yàn)中，質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)抑制率超過了乙醇提取物外，乙醇提取物均表現(xiàn)出更好的抗癌性。

綜上所述，猴頭菇具有作為天然抗氧化劑以及天然抗癌的良好的發(fā)展?jié)摿Γ恼卵芯拷Y(jié)果可為進(jìn)一步分離和純化猴頭菇中的抗氧化和癌性物質(zhì)，以及綜合開發(fā)利用猴頭菇提供理論依據(jù)。