高哲，張梁明慧，李喜悅，崔同*

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院（保定 071000）

棗葉為棗屬植物的葉子，據(jù)《日華子本草》記載，棗葉性味溫，無毒[1]。關(guān)于棗資源的開發(fā)利用主要集中在棗肉方面，沒有針對棗葉進(jìn)行有效的開發(fā)利用，使得棗葉這一珍貴的資源嚴(yán)重浪費(fèi)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，棗葉中含有豐富的黃酮類化合物[2-4]，具有清除自由基、抗氧化、鎮(zhèn)靜安神等多種藥理功效[5-7]。郝紅英等[8]采用響應(yīng)面法超聲波輔助提取新鄭棗葉中總黃酮的工藝進(jìn)行研究；Jin等[9]對棗葉粗提物的抗氧化活性開展研究，結(jié)果表明不只是棗果和酸棗仁具有抑制黃嘌呤氧化酶的活性和推電子能力，棗葉也具有類似的作用；Kim等[10]的研究表明，棗葉的水提物、70%乙醇提取物及80%甲醇提取物均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除ABTS+·和DPPH·的活性，其效果強(qiáng)于棗果；趙欣等[11]研究表明棗葉及棗芽的醇提物對DPPH自由基有顯著的清除作用，它們的平均清除率分別為37.68%和34.14%，且各樣品的清除率存在差異；蔣佳玲等[12]研究表明廣棗葉總黃酮具有明顯的抗心律失常、抗氧化、保護(hù)心肌缺血等作用，對改善心肌缺血再灌注損傷的療效顯著。然而更深入、系統(tǒng)的研究，如不同極性溶劑提取物的抗氧化活性比較等方面均尚未見報道。

實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)不同時期采收的棗葉黃酮的含量差異很大，因此試驗(yàn)以不同時期棗葉的乙醇提取物為原料，對其不同極性的提取物進(jìn)行黃酮總含量和對ABTS+·、DPPH·自由基的清除作用測定，評價其抗氧化活性，為棗葉資源的開發(fā)利用及功能性食品的開發(fā)提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棗葉嫩葉和棗葉老葉分別于2020年5月8日、2020年10月9日采自河北省滄縣國家棗樹良種繁育基地，品種為晉棗，采后自然風(fēng)干，放置在真空干燥器中備用。

Agilent 1200型HPLC（由在線脫氣機(jī)，四元輸液泵，光電二極管陣列檢測器及Agilent Chemstation色譜工作站組成）Agilent公司；CO-3010柱恒溫控制箱（天津美瑞泰克科技有限公司）；LC3000型制備型HPLC（北京創(chuàng)新通恒科技有限公司），配用SinoChrom ODS-BP C18色譜柱（300 mm×20 mm i.d.，10 μm）；LC-MS系統(tǒng)（由Agilent 1200型LC、Agilent6310 型MS檢測器組成，Agilent 公司）；Avance III600 MHz型核磁共振儀（Bruker公司）；TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；TB-215D微量分析天平（德國賽多利斯股份有限公司）；RE-52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；ST-02A型多功能粉碎機(jī)（永康市帥通工具有限公司）；FD-1B-50型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；SK5200H超聲振動儀（上海波龍電子設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同有機(jī)溶劑的棗葉提取

取棗葉嫩葉和老葉樣品各900 g，用多功能粉碎機(jī)粉碎，加入9 L 80%乙醇，不定期攪拌，室溫浸提8 h后將乙醇濾出，加入9 L 95%乙醇重復(fù)提取1次，合并乙醇提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮回收乙醇，得到綠色浸膏。向浸膏中加入適量的水混懸，依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取5～6次，石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水相提取物分別減壓蒸干。其中，乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物經(jīng)制備型高效液相色譜反復(fù)分離純化，得到化合物1，2，3和4。

1.2.2 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用硝酸鋁-亞硝酸鈉顯色法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。分別精密量取0，0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mL 1 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液（甲醇為溶劑），置于10 mL容量瓶中，加入0.3 mL 10% NaNO2溶液，搖勻后靜置6 min，加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻，放置6 min后加入4.0 mL 4% NaOH溶液，用甲醇稀釋定容至10 mL，搖勻，放置15 min，以空白試劑為對照，在510 nm處測定各處理溶液的吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，供試溶液中蘆丁質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得回歸方程為Y=12.44X-0.020 4，R2=0.999 1，定量分析范圍為0.01～0.05 mg/mL。

1.2.3 總黃酮含量的測定

分別準(zhǔn)確稱取18.00 mg石油醚提取物、0.80 mg乙酸乙酯提取物，用甲醇溶解定容至10 mL，稱取1.60 mg乙醇提取物、1.00 mg正丁醇提取物及18.00 mg水相提取物，用50%甲醇溶解后定容至10 mL。分別移取各提取物溶液1 mL替代蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液加入10 mL容量瓶中，其余步驟按照1.2.2所述方法操作，測其吸光度，以相應(yīng)試劑為空白調(diào)零，代入回歸方程計(jì)算出各提取物中的總黃酮含量。

1.2.4 清除DPPH·活性測定

按照文獻(xiàn)方法[14-15]，配制25 mg/L的DPPH·甲醇溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配，避光放置），取上述DPPH·甲醇溶液3.9 mL加入具塞試管，向其中加入0.1 mL不同濃度的被測溶液，漩渦混勻，30 ℃水浴保溫，在黑暗避光處反應(yīng)40 min，于515 nm測定吸光度A，每個樣品做3次重復(fù)，同時以0.1 mL甲醇代替被測溶液做空白試驗(yàn)。以BHT為陽性對照。根據(jù)式（1）計(jì)算DPPH·清除率。

DPPH·清除率=（1-A/A0）×100% （1）式中：A為樣品溶液吸光度；A0為空白溶液吸光度。

分別以各樣品的不同濃度與其對應(yīng)的DPPH·自由基清除率作圖。

1.2.5 清除ABTS+·活性測定

按照文獻(xiàn)[16]，稱取一定量的ABTS自由基，以相應(yīng)量的甲醇為溶劑，配制成7 mmol/L的貯備液；取5 mL ABTS貯備液和88 μL 140 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合，超聲混勻，在室溫、避光條件下靜置過夜，形成ABTS+·貯備液，臨用前將生成的ABTS+·自由基貯備液用甲醇稀釋，使其在734 nm波長下的吸光度為0.70±0.02，即得到ABTS+·工作液，將其避光保存。

取4 mL ABTS+·工作液加入到具塞試管，向其中加入0.04 mL不同濃度的樣品甲醇溶液，漩渦混勻，30 ℃水浴避光反應(yīng)15 min[17]，于734 nm下測定其吸光度A，每個樣品平行3份。同時以0.04 mL甲醇代替樣品甲醇溶液做空白試驗(yàn)。以BHT為陽性對照，根據(jù)式（2）計(jì)算ABTS+·清除率。

ABTS+·清除率=（1-A/A0）×100% （2）式中：A為樣品溶液吸光度；A0為空白溶液吸光度。

分別以各樣品的不同濃度與其對應(yīng)的ABTS+·自由基清除率作圖。

1.2.6 棗葉黃酮的LC-MS分析和核磁共振分析

將得到的化合物1～4溶解于甲醇中，配成質(zhì)量濃度100 μg/mL的混和樣液，用LC-MS聯(lián)用儀進(jìn)行分析。LC條件：色譜柱為Hypersil BDS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流動相A為500 μL/L甲酸水溶液，B為乙腈含500 μL/L甲酸。線性梯度洗脫程序：0 min，15% B；27 min，15% B；32 min，17% B；47 min，17% B；49 min，22% B；65 min，26% B；70 min，100% B；75 min，100% B；77 min，15% B；87 min，15% B；流速0.6 mL/min；檢測波長360 nm；進(jìn)樣量5 μL。MS條件：ESI離子源，陰離子檢測模式，噴霧器壓力45 psi；干燥氣體溫度350 ℃，干燥氣（N2）流速12 L/min；離子阱質(zhì)量分析器掃描范圍m/z=100～1 000。稱取化合物1～4各20 mg，分別用氘代甲醇溶解，以四甲基硅為基準(zhǔn)試劑，在核磁共振儀上進(jìn)行氫譜（1H NMR）和全去偶碳譜（13C NMR）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棗葉嫩葉和老葉不同溶劑提取結(jié)果

按照1.2.1所述方法對棗葉老葉和嫩葉進(jìn)行處理，得到棗嫩葉的石油醚提取物75 g，乙酸乙酯提取物15 g，正丁醇提取物43 g；棗老葉的石油醚提取物68 g，乙酸乙酯提取物30 g，正丁醇提取物32 g。嫩葉中石油醚提取物含量較高，這些成分中含有很多皂苷類成分，是棗葉中重要的保健活性成分。另外，嫩葉的乙酸乙酯提取物與正丁醇提取物的比例接近1∶3，而老葉中兩者比例約為1∶1。

2.2 不同極性溶劑提取物中總黃酮含量

按照1.2.3方法分別測定棗葉嫩葉和老葉中乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水相部位的提取物總黃酮含量（見圖1和圖2）。老葉各提取物的含量略高于嫩葉。而不同溶劑的各種提取物中總黃酮的含量有較大差異，乙酸乙酯部位的總黃酮含量最高，分別達(dá)到232.5 mg/g（嫩葉）和282.3 mg/g（老葉），明顯高于其他提取物；含量最低的均為石油醚相，分別為8.52 mg/g（嫩葉）、10.32 mg/g（老葉）。嫩葉總黃酮含量高低順序?yàn)椋阂宜嵋阴ヌ崛∥铮疽掖继崛∥铮菊〈继崛∥铮舅鄽埩粑铮臼兔烟崛∥?；老葉總黃酮含量大小順序?yàn)椋阂宜嵋阴ヌ崛∥铮菊〈继崛∥铮疽掖继崛∥铮舅鄽堄辔铮臼兔烟崛∥铩Ｊ兔褜儆诜菢O性有機(jī)溶劑，僅能提取出棗葉中少量的中等極性的黃酮類成分；水相中的黃酮含量也很低，則是由于使用不同極性的溶劑提取的過程中，乙酸乙酯和正丁醇這些具有中強(qiáng)極性的溶劑已經(jīng)將絕大部分黃酮提取出去，只有極小一部分水溶性極好的黃酮類物質(zhì)殘留在水中[18]。

圖1 棗葉嫩葉各提取物的總黃酮含量

圖2 棗葉老葉各提取物的總黃酮含量

2.3 不同極性溶劑提取物清除自由基結(jié)果

2.3.1 對DPPH·自由基的清除作用

棗葉各提取物在0.2～1.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)清除DPPH·自由基活性的結(jié)果如圖3（嫩葉）和圖4（老葉）所示。棗葉不同極性提取物均對DPPH·自由基具有一定的清除能力，在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，隨著樣品溶液質(zhì)量濃度增加，清除率也隨之增強(qiáng)，在同等質(zhì)量濃度下，棗葉老葉比嫩葉表現(xiàn)出稍高的活性。其中，乙酸乙酯相表現(xiàn)出最高的活性，在乙酸乙酯相質(zhì)量濃度1.0 mg/mL時清除率達(dá)到最大，嫩葉為75.15%，老葉為74.11%，其清除能力略低于陽性對照BHT；乙醇和正丁醇提取物的活性比較接近，而水相和石油醚相的能力均較弱。嫩葉對DPPH·清除能力大小順序?yàn)椋阂宜嵋阴ィ疽掖迹菊〈迹舅臼兔?。老葉對DPPH·清除能力大小順序?yàn)椋阂宜嵋阴ィ菊〈迹疽掖迹舅臼兔选?/p>

圖3 棗葉嫩葉不同提取物對DPPH·自由基清除率

圖4 棗葉老葉不同提取物對DPPH·自由基清除率

2.3.2 對ABTS+自由基的清除作用

棗葉各提取物在0.2～1.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)清除ABTS+·自由基活性的結(jié)果如圖5（嫩葉）和圖6（老葉）所示。棗葉不同提取物對ABTS+·自由基均具有一定的清除能力，但從總體而言，其清除活性較DPPH·自由基（見圖3和圖4）偏弱。具體來看，其清除率隨質(zhì)量濃度升高而升高，且老葉各提取物比嫩葉表現(xiàn)出稍高的活性。其中，乙醇提取物在1.0 mg/mL時對ABTS+·自由基清除率為45.73%（嫩葉）和51.14%（老葉），但低于陽性對照BHT。嫩葉提取物對ABTS+·自由基的清除順序?yàn)椋阂掖迹舅菊〈迹疽宜嵋阴ィ臼兔选Ｖ档米⒁獾氖?，嫩葉水相表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除ABTS+·自由基能力，但其清除DPPH·自由基能力卻很弱，這可能與不同極性提取物中含有的化合物的種類及不同清除自由基試驗(yàn)的作用機(jī)理有一定關(guān)系[19]。因而棗葉提取物的不同極性部位對不同類型的自由基表現(xiàn)出不同程度的清除作用。老葉提取物對ABTS+·自由基的清除順序?yàn)椋阂掖迹菊〈迹疽宜嵋阴ィ舅臼兔选?/p>

圖5 棗葉嫩葉不同提取物對ABTS+·自由基清除率

圖6 棗葉老葉不同提取物對ABTS+·自由基清除率

2.4 清除ABTS+·與DPPH自由基能力的相關(guān)性分析

棗葉各提取物清除ABTS+·與DPPH·自由基能力的相關(guān)性如表1所示。由表1可以看出，無論是棗葉嫩葉還是老葉，其清除ABTS+·與DPPH·的能力并沒有表現(xiàn)出顯著相關(guān)性，差別較大，這可能與各抗氧化模型作用機(jī)理不同及棗葉中所含抗氧化活性物質(zhì)的類型有關(guān)。

表1 棗葉嫩葉和老葉清除ABTS+·和DPPH·自由基能力的相關(guān)系數(shù)（r）

2.5 總黃酮含量與清除自由基能力的相關(guān)性分析

棗葉提取物總黃酮含量與清除自由基能力的相關(guān)性如表2所示。質(zhì)量濃度0.6 mg/mL的各棗葉提取物中總黃酮含量與清除DPPH·自由基能力之間有很強(qiáng)的相關(guān)性，其中嫩葉總黃酮含量與DPPH·自由基清除能力間相關(guān)系數(shù)為0.996，達(dá)到相關(guān)性極顯著水平（p＜0.01），老葉對DPPH·自由基的清除能力的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.958，為顯著相關(guān)（p＜0.05），因此可以認(rèn)為棗葉提取物中總黃酮含量的多少直接反映提取物清除DPPH·自由基能力的強(qiáng)弱。棗葉嫩葉和老葉中總黃酮含量與ABTS+·自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)分別為0.389和0.540，顯示不同極性的棗葉提取物中黃酮的含量雖然與其清除ABTS+·自由基的能力之間存在一定的正相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)系數(shù)沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著水平。

表2 棗葉各提取物清除自由基活性與總黃酮含量的相關(guān)性

2.6 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

由2.2的結(jié)果表明，棗葉乙酸乙酯部位和正丁醇部位活性較強(qiáng)，因此選取乙酸乙酯和正丁醇部位進(jìn)行分離制備，前期得到5種化合物[20]，在這基礎(chǔ)上分離到4種化合物，經(jīng)鑒定分別為槲皮素鼠李糖-對羥基桂皮酰葡萄糖、3′，5′-間-C-β-D-吡喃葡萄糖基-4-O-香豆?；に?、3′，5′-間-C-β-D-吡喃葡萄糖基根皮素、槲皮素-3-O-鼠李糖苷。

3 結(jié)論

采用不同溶劑提取棗葉，提取物中總黃酮含量差異較大，嫩葉和老葉各提取物中乙酸乙酯部位總黃酮含量均最高，明顯高于其他提取物；在不同清除自由基體系中，各提取物均具有不同程度的清除自由基能力且與其質(zhì)量濃度呈量效關(guān)系，但活性強(qiáng)弱順序各不相同，棗葉乙酸乙酯部位清除DPPH·的能力最強(qiáng)，而棗葉乙醇提取物清除ABTS+·自由基的能力最強(qiáng)。棗葉總黃酮含量與清除DPPH·自由基間呈現(xiàn)顯著相關(guān)性，而與清除ABTS+·自由基之間相關(guān)性較小。

槲皮素鼠李糖-對羥基桂皮酰葡萄糖、3′，5′-間-C-β-D-吡喃葡萄糖基-4-O-香豆?；に貫樵跅棇僦参镏械男掳l(fā)現(xiàn)。