林歡

摘 要：菠菜葉片中富含多種天然色素，天然色素廣泛用于各個(gè)領(lǐng)域，整個(gè)社會(huì)對于天然色素的需求量在不斷提高，色素的提取和分離方法日益重要。然而提取分離色素仍然面臨著耗時(shí)長，產(chǎn)能低，環(huán)境污染嚴(yán)重等問題。為了尋找解決這些問題的方法，本實(shí)驗(yàn)通過薄層層析和柱層析法探究提取分離色素的最佳工藝，并測定各色素Rf值，測繪各色素的紫外光譜圖，為后續(xù)研究提供數(shù)據(jù)支撐。通過本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)薄層層析法比柱層析法各具有優(yōu)勢，時(shí)間耗時(shí)更少，分離效果更為準(zhǔn)確，但若要單次分離較多色素則用柱層法。

關(guān)鍵詞：菠菜;色素;提取方法;薄層層析;柱層析法

一、前言

綠色植物葉綠體中含有許多天然色素。以菠菜為例，它富含葉綠素，胡蘿卜素和葉黃素等多種天然食用色素，其中葉綠素可以作為植物光合作用的催化劑，具有殺菌、除臭、解熱、止血等功能;胡蘿卜素具有維生素A的生理活性和抗氧化作用，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品及飼料添加劑等方面;葉黃素可抗衰老，抗突變，是天然的食品色素和食品營養(yǎng)劑。這些天然色素在食品、醫(yī)藥等方面運(yùn)用廣泛，在人類社會(huì)中發(fā)揮著不可替代的作用，社會(huì)對天然色素的需求量也在不斷地提高。

而隨著社會(huì)對天然色素的需求量提高，改進(jìn)和優(yōu)化色素的提取和分離技術(shù)的重要性日益突出，現(xiàn)主要的提取方法主要是利用有機(jī)溶劑的提取，由于其所用溶劑多為有毒試劑，仍存在著許多弊端。如今絕大部分的分離法均為色譜法的衍生，其主要包括了薄層層析，吸附柱層析，紙層析法，高效液相色譜法等，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。

基于前人的研究，通過收集數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)前人測得的葉綠素，葉黃素和胡蘿卜素的Rf值有些許差異。于是在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用薄層層析和吸附柱層析方法分離菠菜中的色素，比較兩種方法的效率差異，測量出各色素的Rf值和測定四種色素的紫外光譜。以供為后續(xù)研究者提供數(shù)據(jù)佐證。

二、實(shí)驗(yàn)部分

1.材料與試劑

菠菜葉、硅膠、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、堿性三氧化二鋁、無水硫酸鈉、中性氧化鋁、濾紙、棉花

2.實(shí)驗(yàn)儀器

剪刀、研缽、布氏漏斗、圓底燒瓶、分液漏斗、直形冷凝管、 層析柱、抽濾瓶、燒杯、鐵架臺(tái)、脫脂棉、分光光度計(jì)、載玻片

3.實(shí)驗(yàn)步驟

3.1提取菠菜色素

提取方法大致可分為抽濾法、浸泡法、亞臨界萃取、超聲波提取以及微波提取等方法。本次實(shí)驗(yàn)采取傳統(tǒng)的抽濾法來提取色素，其具體步驟如下：取5g新鮮菠菜葉用剪刀剪碎與20ml甲醇攪拌研磨5min，研磨時(shí)加入少許二氧化硅和碳酸鈣，并加入少量的甲醇然后用布式漏斗抽綠菠菜汁，棄去濾液。然后用石油醚甲醇體積比為3：1的混合溶液對殘?jiān)M(jìn)行萃取，萃取兩次。將萃取液轉(zhuǎn)入分液漏斗，用水洗滌兩次。棄去水甲醇層和石油醚層用無水硫酸鈉干燥，然后過濾再進(jìn)行水浴。

3.2分離菠菜色素

分離方法大致可分為紙層析法，薄層析法和柱層析等方法。這些操作方法，大體相同且各有優(yōu)缺點(diǎn)。它們都是色譜法的衍生，色譜法是現(xiàn)代分析化學(xué)中重要的分離、分析技術(shù)，它是由俄國植物學(xué)家茨維特發(fā)明的，它的原理為當(dāng)樣品流過固定相時(shí)，因樣品中不同組分在兩相中的分配系數(shù)不同，它們的移動(dòng)速度不同，從而使樣品分離。目前而言，絕大部分分離方法都是色譜法的衍生，也許在色譜法之外，有更好的分離方法，但這方面的研究幾乎沒有。本次實(shí)驗(yàn)采取了技術(shù)較為成熟的薄層層析和柱層析法來進(jìn)行分離菠菜色素，以此來對比其分離效率以及效果。

3.2.1薄層層析

利用在載玻片和硅膠，提前準(zhǔn)備好層析板。此次實(shí)驗(yàn)采用石油醚丙酮8：2和石油醚乙酸乙酯6：4體積比兩種混合溶液為展開劑，別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并對比結(jié)果?；罨影宀Ⅻc(diǎn)樣，將其放入加有展開劑的廣口瓶內(nèi)，在內(nèi)壁貼一張高為5cm 繞周長約4/ 5的濾紙，蓋好瓶蓋，待展開劑上升到指定高度時(shí)取出，根據(jù)斑點(diǎn)位置求出Rf值。

3.2.2柱層析

將20×10cm的層析柱石油醚和中性氧化鋁填裝，將菠菜葉的濃縮液滴加到頂部，然后打開下部活塞，使液面下降至柱面以下1mm左右，再關(guān)閉活塞，加入石油醚沖洗內(nèi)壁，再打開活塞是使液面下降，反復(fù)幾次使色素全部進(jìn)入主體帶色素全部進(jìn)入柱體后，在頂部小心加約1.5～2cm高度的洗脫劑在下面用錐形瓶收集。洗脫劑成分為9：1的石油醚丙酮溶液和1：7的石油醚丙酮混合液，分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并對比結(jié)果。將收集到的色素進(jìn)行紫外光譜測定。

三、結(jié)果與討論

1.測量數(shù)據(jù)

1.1各色素Rf值

葉綠素b的Rf值=0.38

葉綠素a的Rf值=0.53

胡蘿卜素Rf值=1

葉黃素的Rf值=0.78。

1.2各色素的紫外光譜

葉綠素b在645nm和663nm處都有吸收，但在645nm處吸光系數(shù)較大，為45.60，在663nm處較小，為9.27。

葉綠素a在645nm和663nm處皆有吸收，但在645nm處吸光系數(shù)較小，為16.75，在663nm處較大為82.04。

胡蘿卜素在400nm到500nm之間均有吸收，在500nm處吸光系數(shù)較大為56.78，在400nm處吸光系數(shù)較小，為25.65。

葉黃素在444nm處有最大吸收峰。

1.3數(shù)據(jù)分析

綜上所得，胡蘿卜素的Rf值最大，葉黃素次之，葉綠素a和葉綠素b的Rf值相近。四種色素的紫外光譜有所差異，其中葉綠素a和葉綠素b的最為相似。所測得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與劉志偉[1]所測的數(shù)據(jù)較為相似，他測得的數(shù)據(jù)是在石油醚乙酸乙酯6：4 情況下，胡蘿卜素Rf值為0.98，葉黃素為0.82 葉綠素為0.61。在他進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，并沒有區(qū)分此葉綠素為葉綠素a還是葉綠素b，根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)所測的數(shù)據(jù)此結(jié)果與測得的葉綠素a的值更為相似，所以可以判斷他所測得的是葉綠素a。

2.實(shí)驗(yàn)條件的選擇和優(yōu)化

本次實(shí)驗(yàn)并未對菠菜色素提取方法進(jìn)行細(xì)致研究，直接采取了最為傳統(tǒng)且廣泛的抽濾法進(jìn)行提取。但從實(shí)際而言，抽濾法缺點(diǎn)明顯，抽濾不好控制，容易使非極性溶劑抽走并且操作復(fù)雜，提取純度較低。與本次實(shí)驗(yàn)而言，提取結(jié)果對分離結(jié)果會(huì)產(chǎn)生一定影響。若要提高其純度，可采取浸泡法、亞臨界萃取、超聲波提取和微波提取等方法。郭松斌對通過以上方法提取出的色素進(jìn)行了精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，指出超聲波提取和微波提取雖可以提高提取效率，但由于超聲波的空化效應(yīng)，微波的熱傳導(dǎo)作用不利于天然色素特性的保留，而亞臨界萃取過程沒有加熱，所以他覺得亞臨界萃取法相對而言更為適宜[2]本次實(shí)驗(yàn)利用甲醇來提取色素，但由于甲醇有毒危險(xiǎn)性較高，而乙醇與甲醇極性相距不大，且無毒，所以可以用乙醇來代替甲醇提取色素，此方法更為安全，對提取效果影響不大。所以下次可嘗試用亞臨界萃取法和乙醇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

菠菜色素分離方法較多，本次實(shí)驗(yàn)只采用了薄層層析和柱層析法。通過對比可得，薄層層析法分離迅速，效果好，斑點(diǎn)清晰而集中，故可以用來快速定性，也被運(yùn)用在微量分離中。柱層析法分離效果明顯，分離量較大，但所需時(shí)間較長，吸附劑氧化鋁及洗脫劑用量較大，成本較高，操作較難，成功率較低。兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，可根據(jù)具體需要采取相應(yīng)方法，以本次實(shí)驗(yàn)為例，采取薄層層析法法較為合適。

在運(yùn)用薄層層析法時(shí)，本實(shí)驗(yàn)選取了兩種展開劑，通過對比得，在不同的展開劑作用下，分離結(jié)果有著而顯著差異?？梢娬归_劑是影響色譜分離度的重要因素，其原理大致可概括為展開劑的極性越大，對特定化合物的洗脫能力也越大。常用展開劑按照極性從小到大的順序排列大概為石油醚小于己烷小于甲苯小于苯小于氯仿小于乙醚小于乙酸乙酯小于丙酮小于乙醇小于甲醇小于乙酸。有部分研究者指出以石油醚丙酮苯混合溶液為展開劑時(shí)效果最佳，也許未來實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)可從此進(jìn)行。

在運(yùn)用柱層析法時(shí)，我們選用的洗脫劑為9：1體積比的石油醚丙酮溶液，在此條件下各色素的分離速度較快，但分離時(shí)色素有疊加效應(yīng)，分離效果一般，所用溶劑種類多，用量大。劉志偉通過實(shí)驗(yàn)提出以石油醚乙酸乙酯3：2為洗脫劑時(shí)，分離速度較快，且分離效果較好。[1]

3.誤差總結(jié)

選取不同的展開劑或洗脫劑均會(huì)對所測得的結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，甚至于改變藥劑各成分的比例也會(huì)有細(xì)微的不同，因此選擇合適的展開劑洗脫劑是提取和分離色素的關(guān)鍵。在此基礎(chǔ)上，選擇合適的提取時(shí)間和分離時(shí)間也極為重要。若時(shí)間太短，則提取不充分，所得的色素相對而言較少，各色素不能完全分離，仍混合在一起。此時(shí)測出的各個(gè)色素的Rf值和紫外光譜圖就存在誤差。 若時(shí)間太長，則提取的色素有可能會(huì)溶解在有機(jī)溶劑中 ，從而使提取量變小，也會(huì)導(dǎo)致誤差較大的情況。因此提取和分離時(shí)間的選擇，是誤差是否存在的重要因素。

結(jié)束語

采用了薄層層析和柱層析法對菠菜中色素提取和分離進(jìn)行了探究，通過對提取溶劑，洗脫劑種類進(jìn)行研究，探究提取和分離色素的最佳條件，并測定各色素Rf值，測繪各色素的紫外光譜圖，為后續(xù)研究提供數(shù)據(jù)支撐。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，可以用乙醇來代替甲醇提取色素，可以減少部分對環(huán)境的污染。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對比后發(fā)現(xiàn)，石油醚乙酸乙酯6 ：4 體積比，作為展開劑時(shí)，相對而言效果較為明顯，以9：1石油醚丙酮溶液為洗脫劑，相對而言效果更為明顯。當(dāng)然并不是說以上兩種是最佳的展開劑或洗脫劑，還有更好的更高效的洗脫劑或展開劑等著我們?nèi)ヌ骄浚骄糠椒梢源藢?shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)進(jìn)行改進(jìn)，其所測的數(shù)據(jù)可與本次實(shí)驗(yàn)測得的數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，以證明所探究試劑對提取色素的準(zhǔn)確性。

參考文獻(xiàn)

[1]李志偉.半微量-微量技術(shù)在菠菜色素提取與分離的中的應(yīng)用[J].化學(xué)教育，2019（40）：55-57

[2]郭松斌. 蔬菜中色素檢測及在卷煙中的應(yīng)用[J]. 食品工業(yè)，2017， 38（3）