李軍?劉雨亮?李靜?李純璞?陶宗玉?張文正?張建?魏開(kāi)斌

摘? 要：目的? 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究黃芪-川芎藥對(duì)治療股骨頭缺血性壞死的分子作用機(jī)制。方法? 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)）篩選出黃芪-川芎藥的主要活性成分及作用靶點(diǎn)，應(yīng)用GenneCards數(shù)據(jù)庫(kù)與維恩圖獲取黃芪-川芎藥對(duì)與股骨頭缺血性壞死的共同作用靶點(diǎn)，運(yùn)用Cytoscape 3.7.1軟件和STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行中藥-疾病-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析，最后進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和基因相互作用（KEGG）通路分析，通過(guò)分析得出結(jié)果。結(jié)果? 黃芪-川芎藥對(duì)主要通過(guò)22種活性成分、38個(gè)作用靶點(diǎn)及35個(gè)生物學(xué)通路發(fā)揮作用治療股骨頭缺血性壞死。其中主要活性成分為槲皮素、山奈酚和芒柄花素;主要核心靶點(diǎn)為AKT1;關(guān)鍵通路為PI3K-Akt信號(hào)通路。結(jié)論? 通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究揭示黃芪-川芎藥對(duì)系通過(guò)多種成分、多個(gè)靶點(diǎn)、多種通路治療股骨頭缺血性壞死，為后續(xù)研究開(kāi)展試驗(yàn)工作提供了思路和理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);黃芪;川芎;股骨頭缺血性壞死;作用機(jī)制

中圖分類號(hào)：R285 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-8011（2022）-13-00-04

股骨頭缺血性壞死（Avascular necrosis of the femoral head）因其高致殘率、早期保髖方法的療效不理想及其發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，成為目前臨床治療的難題之一。隨著近年來(lái)糖皮質(zhì)激素較廣泛的臨床應(yīng)用，導(dǎo)致股骨頭缺血性壞死疾病的發(fā)病率不斷攀升，而早期有效、臨床療效滿意的保髖治療方法亟需探討。目前該疾病保髖治療的現(xiàn)狀：西藥保髖治療僅能改善癥狀，難以阻斷疾病進(jìn)展;保髖手術(shù)方式創(chuàng)傷大且療效欠佳;而中醫(yī)藥治療具有多種組分、多個(gè)靶點(diǎn)、多種機(jī)制等特點(diǎn)，在保髖治療方式中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，并取得了良好的臨床效果，這使得對(duì)有效治療的具體藥物及其作用機(jī)制進(jìn)行下一步探討研究尤為重要[1]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為股骨頭缺血性壞死疾病的發(fā)病原因系腎精不足、氣血兩虛、寒濕痰瘀痹阻所致，導(dǎo)致肌肉筋骨失養(yǎng)、氣血滯澀不暢的病機(jī)，并將該疾病歸于“骨痹”“骨痿”或“骨蝕”等病證范疇。黃芪-川芎藥對(duì)具有益氣健脾補(bǔ)腎，化瘀活血通絡(luò)之功，契合股骨頭缺血性壞死的病理機(jī)制。有研究表明，非創(chuàng)傷性股骨頭壞死通過(guò)黃芪生骨湯聯(lián)合手術(shù)治療可改善其中醫(yī)證候，有效且安全[2];股骨頭壞死區(qū)的骨內(nèi)壓通過(guò)使用黃芪復(fù)方制劑能得到有效降低。川芎的主要成分為川芎嗪，具有增強(qiáng)股骨頭血管化的作用，可有效預(yù)防類固醇藥物誘導(dǎo)的骨壞死。綜上所述，黃芪-川芎藥對(duì)是治療股骨頭缺血性壞死疾病的潛在藥物，其具體作用機(jī)制有待深入研究。

1? 資料與方法

1.1? 黃芪-川芎藥對(duì)的活性成分和靶點(diǎn)檢索與收集

以“中藥名稱”為關(guān)鍵詞在TCMSP系統(tǒng)（https：//tcmsp- e.com/）[3]中檢索黃芪和川芎的組成成分及藥物所含化學(xué)成分信息，設(shè)定閾值口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18作為篩選藥物關(guān)鍵活性化合物的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步查找黃芪藥物和川芎藥物的化學(xué)成分相對(duì)應(yīng)的蛋白作用靶點(diǎn)。最后使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)給靶點(diǎn)添加基因縮寫，并去除掉重復(fù)靶點(diǎn)，進(jìn)行規(guī)范化處理。

1.2? 股骨頭缺血性壞死疾病靶點(diǎn)的搜索與收集

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入疾病關(guān)鍵詞“avascular necrosis of the femoral head”，進(jìn)行搜索并收集相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3? 中藥-疾病共有靶點(diǎn)的獲取

采用Venn圖對(duì)藥物靶點(diǎn)、疾病靶點(diǎn)一同進(jìn)行映射，獲取黃芪-川芎藥對(duì)治療股骨頭缺血性壞死疾病潛在的作用靶點(diǎn)。

1.4? 構(gòu)建藥物-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

采用Cytoscape 3.7.1軟件，對(duì)藥物、活性成分、關(guān)鍵靶基因、疾病及其之間的相互對(duì)應(yīng)關(guān)系進(jìn)行可視化并導(dǎo)出網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5? 構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用（Protein- Protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)

將潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)，將物種設(shè)置為人，以“minimum required interaction score>0.700”為條件，分析獲取PPI關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，下載文件并輸出圖形，利用cytohubba插件對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行篩選。

1.6? GO生物功能富集分析和KEGG通路分析

基于 Bioconductor中的 R 包ClusterProfiler對(duì)核心靶標(biāo)進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和基因相互作用（KEGG）通路分析，選擇P和Q均小于0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。輸出結(jié)果同時(shí)并繪制出bubbleplot氣泡圖，分析輸出的結(jié)果，探討黃芪-川芎藥對(duì)的潛在作用機(jī)制。

2? 結(jié)果

2.1? 黃芪-川芎藥對(duì)的活性成分及靶點(diǎn)

通過(guò)TCMSP系統(tǒng)檢索后，篩選出黃芪藥物的有效成分17個(gè)且相對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)179個(gè)，川芎藥物的有效成分6個(gè)且相對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)29個(gè)。使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匯總，并刪除篩選出的重復(fù)數(shù)據(jù)，最終檢索結(jié)果為黃芪-川芎藥對(duì)的活性成分共計(jì)22個(gè)，如芒柄花素（formononetin）、槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、異鼠李素（isorhamnetin）、楊梅酮（Myricanone）、川芎哚（Perlolyrine）、谷甾醇（sitosterol）1，7-二羥基-3，9-二甲氧基紫檀烯（1，7-Dihydroxy-3，9-dimethoxy pterocarpene）、毛蕊異黃酮（Calycosin）、聯(lián)苯雙酯（Bifendate）等;相對(duì)應(yīng)作用靶點(diǎn)共計(jì)181個(gè)。

2.2? 股骨頭缺血性壞死疾病靶點(diǎn)

應(yīng)用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)共收集股骨頭缺血性壞死疾病的靶點(diǎn)272個(gè)。

2.3? 中藥-疾病共有靶點(diǎn)

將藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)采用Venn圖映射方式取交集，得到黃芪-川芎藥對(duì)治療股骨頭缺血性壞死的潛在作用靶點(diǎn)38個(gè)，如KT1、PTGS2、CCL2、IL1B、MMP9、TP53、CXCL8、IFNG等，提示黃芪-川芎藥對(duì)可能通過(guò)這些潛在作用靶點(diǎn)發(fā)揮其相應(yīng)的治療作用。

2.4? 成分-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)圖

左邊圓形狀圖標(biāo)中的MOL00433、001404、002135、002140、002157代表川芎藥物的有效活性化學(xué)成分，其他圓形狀圖標(biāo)代表黃芪藥的有效活性化學(xué)成分;右邊方塊形狀圖標(biāo)代表的潛在的作用靶點(diǎn)。圖片清楚地顯示了不同活性化學(xué)成分與不同作用靶點(diǎn)相互作用的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，也充分說(shuō)明了黃芪-川芎藥對(duì)是通過(guò)多種活性成分、多個(gè)作用靶點(diǎn)及多種通路起效的，其中槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）和芒柄花素（formononetin）關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)較多，系該藥對(duì)中最主要的活性成分。見(jiàn)圖1。

2.5? 網(wǎng)絡(luò)蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

PPI網(wǎng)絡(luò)圖（見(jiàn)圖2）中包含38個(gè)節(jié)點(diǎn)和節(jié)點(diǎn)間相互連接的390條邊，其中節(jié)點(diǎn)代表的是蛋白，邊代表的系蛋白與蛋白間的作用關(guān)系，網(wǎng)絡(luò)連接程度越高越密集說(shuō)明蛋白間關(guān)系密切度越高。為尋找出其中的核心蛋白，需再采用 CytoHubba 插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)浞治?，從而進(jìn)一步從網(wǎng)絡(luò)圖中篩選出核心蛋白。在網(wǎng)絡(luò)中“度值”（degree）是一種重要的拓?fù)鋮?shù)之一，利用節(jié)點(diǎn)度值的高低來(lái)確定網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，其中網(wǎng)絡(luò)圖中和某個(gè)節(jié)點(diǎn)相連的所有節(jié)點(diǎn)的總數(shù)量即表示為某個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值，該方法常用于評(píng)估網(wǎng)絡(luò)中某種成分或目標(biāo)的重要性[4]。因此，篩選條件按Degree進(jìn)行排列，其中某個(gè)節(jié)點(diǎn)的顏色越深且圓形越大，表明該節(jié)點(diǎn)的RANK更靠前，關(guān)鍵性更高。在核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（見(jiàn)圖3）中度值最高的靶點(diǎn)是AKT1（degree=34），即可認(rèn)為其為核心靶點(diǎn)，黃芪-川芎藥對(duì)主要是通過(guò)AKT1靶點(diǎn)而發(fā)揮其治療股骨頭缺血性壞死疾病的作用。

2.6? GO富集分析和KEGG通路分析

GO富集中的交集基因主要參與以下生物過(guò)程：炎性反應(yīng)、脂多糖、活性氧代謝過(guò)程、白細(xì)胞細(xì)胞間黏附和T細(xì)胞活化等（見(jiàn)圖4）。KEGG主要涉及 PI3K-AkT、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、AGE-RAGE、IL-17和TNF信號(hào)通路（見(jiàn)圖5）。其中，PI3K-AkT通路中由于有核心靶點(diǎn)AkT1的參與，該通路被認(rèn)為是黃芪-川芎藥對(duì)治療股骨頭缺血性壞死的關(guān)鍵通路。

3? 討論

目前認(rèn)為酒精、激素等誘發(fā)的炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等病理改變，造成了股骨頭內(nèi)血管的損傷及成骨的不足，從而導(dǎo)致股骨頭缺血性壞死疾病的發(fā)生，其典型的病理變化為成骨細(xì)胞分化的減少、髓內(nèi)脂肪細(xì)胞的增強(qiáng)并沉積及骨循環(huán)的受損[5]，最終導(dǎo)致股骨頭塌陷變形，致使患者疼痛、活動(dòng)受限，嚴(yán)重者患肢致殘，日常生活難以自理，最終要靠全髖關(guān)節(jié)置換解除痛苦，而年輕患者不得不面臨再次置換或返修的風(fēng)險(xiǎn)。目前西醫(yī)保髖治療該疾病的療效并不理想，而中醫(yī)藥具有多組分、多靶點(diǎn)、多機(jī)制的作用特點(diǎn)，為股骨頭壞死的整體治療方面開(kāi)拓新思路，通過(guò)辨證施治從而取得了較好的療效，受到了患者及家屬的認(rèn)可。目前研究[2]黃芪生骨湯聯(lián)合手術(shù)治療、活血通絡(luò)湯（含黃芪、丹參、川芎、當(dāng)歸、巴戟天、地龍、懷牛膝、雞內(nèi)金）等治療該疾病取得了良好的療效。因此，黃芪-川芎藥對(duì)是治療股骨頭缺血性壞死疾病的潛在藥物，開(kāi)發(fā)中醫(yī)藥治療股骨頭缺血性壞死的新方法以及研究其潛在的作用機(jī)制具有非常重要意義[6]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，建立“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，本研究發(fā)現(xiàn)黃芪-川芎藥對(duì)治療股骨頭缺血性壞死疾病主要是通過(guò)22種活性成分、38個(gè)作用靶點(diǎn)及35個(gè)生物學(xué)通路發(fā)揮其治療作用。其中槲皮素、山奈酚和芒柄花素為主要活性成分;AKT1為核心靶點(diǎn);磷酸肌醇3激酶（PI3K）/AKT信號(hào)通路為關(guān)鍵信號(hào)通路。槲皮素是天然存在的多酚類化合物，文獻(xiàn)報(bào)道[7]槲皮素既能通過(guò)增加成骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)而激活成骨細(xì)胞的生成作用;又能對(duì)破骨細(xì)胞的形成、增殖和成熟起抑制作用。其他藥理研究表明槲皮素還具有抗炎、抗氧化劑和免疫調(diào)節(jié)功能，能減輕免疫細(xì)胞炎癥因子的分泌，其作用機(jī)制與抑制核因子-κB、蛋白激酶B的磷酸化有關(guān);槲皮素對(duì)疼痛類疾病的緩解具有良好藥理作用，并且該藥物的不良反應(yīng)小，故其藥用前景較好[8]。山奈酚在多項(xiàng)體外研究中表明其具有引起破骨細(xì)胞因子的下調(diào)而發(fā)揮抗破骨細(xì)胞活性的作用[9];同時(shí)抑制骨髓脂肪細(xì)胞的形成;并能刺激前成骨細(xì)胞分化和礦化，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，其機(jī)制是通過(guò)細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶和雌激素受體途徑來(lái)提高成骨細(xì)胞內(nèi)ALP活性而實(shí)現(xiàn)。

芒柄花素作為異黃酮類單體，首先在雞血藤被發(fā)現(xiàn)，研究表明其可通過(guò)激活p38絲裂原活化蛋白激酶途徑刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞的再生，增加骨量而修復(fù)骨皮質(zhì)缺損，已被前期的研究證明[10];也有近期研究表明芒柄花素對(duì)與骨細(xì)胞骨吸收相關(guān)的功能基因（如CTSK、TRAP、MMP9、Car 2等）的表達(dá)起到顯著的抑制作用，因此被認(rèn)為其同時(shí)具有調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性功能，在治療股骨頭壞死導(dǎo)致骨結(jié)構(gòu)破壞和骨塌陷方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)藥物之一。PI3K/AkT信號(hào)通路在細(xì)胞的存活、增殖、生長(zhǎng)和分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，也是骨質(zhì)恢復(fù)再生的重要信號(hào)通路，通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的增殖分化而促進(jìn)骨重塑的過(guò)程。磷酸酶和緊張素同源物通過(guò)PI3K/AKT/VEGF通路調(diào)節(jié)人胰腺癌細(xì)胞的血管生成。外泌體依靠激活PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)骨再生。人參皂苷可通過(guò)PI3K/AKT通路保護(hù)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的大鼠骨髓干細(xì)胞凋亡。LV等[11]證明骨碎補(bǔ)總黃酮可以通過(guò)PI3K/AKT通路改善類固醇誘導(dǎo)的股骨頭缺血性壞死。Zhan等[12]發(fā)現(xiàn)大蒜素可以通過(guò)激活PI3K/AKT通路來(lái)抑制成骨細(xì)胞凋亡和類固醇誘導(dǎo)的股骨頭壞死。PI3K-Akt信號(hào)通路不僅能增強(qiáng)成骨細(xì)胞增殖的活性，而且可促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化增殖，其作用機(jī)制系通過(guò)糖原合成激酶3β來(lái)實(shí)現(xiàn)Wnt/β-catenin的調(diào)控[13]。此外，該信號(hào)通路亦能通過(guò)成骨細(xì)胞釋放兩種關(guān)鍵的因子：巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受體活化因子配體（RANKL），從而觸發(fā)破骨細(xì)胞分化。隨著RANKL同受體結(jié)合后，其下游的信號(hào)（NF-κB、JNK、p38MAPK） 就會(huì)被相繼激活，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化。c-fos、活化T細(xì)胞核因子1等也調(diào)控其下游信號(hào)激酶（NF-κB、p38MAPK） 的表達(dá)，影響破骨細(xì)胞的分化。故黃芪-川芎藥對(duì)能通過(guò)調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路，調(diào)控股骨頭的骨質(zhì)代謝，促使股骨頭壞死區(qū)骨質(zhì)的代謝及新骨的再生。

綜上所述，本文結(jié)果研究發(fā)現(xiàn)黃芪-川芎藥對(duì)中的槲皮素、山奈酚和芒柄花素等活性成分作用于主要的分子靶點(diǎn)AKT1，涉及并參與炎性反應(yīng)、脂多糖、活性氧代謝過(guò)程、白細(xì)胞細(xì)胞間黏附和T細(xì)胞活化等多個(gè)生物過(guò)程，并通過(guò)PI3K/AkT信號(hào)通路，增加成骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，激活成骨細(xì)胞的生成作用;同時(shí)又對(duì)破骨細(xì)胞的形成、增殖和成熟起抑制作用，具有調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性的雙層功能，發(fā)揮其對(duì)股骨頭缺血性壞死疾病導(dǎo)致骨結(jié)構(gòu)破壞和骨塌陷等方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。相信隨著科學(xué)技術(shù)日新月異的發(fā)展、系統(tǒng)生物學(xué)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的不斷深入與完善，中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論將會(huì)獲得更充足的科學(xué)論證。目前雖然股骨頭缺血性壞死疾病的發(fā)病原因、病理變化機(jī)制仍未完全明確，但本研究在分子機(jī)制上對(duì)黃芪-川芎藥對(duì)在防治該疾病相關(guān)的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行相關(guān)的探討，研究證實(shí)該藥對(duì)在治療股骨頭壞死方面具有較好的理論價(jià)值，以期為后續(xù)具體實(shí)驗(yàn)提供思路和理論依據(jù)。

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