周 玉，倪衛(wèi)星，劉 勇，黃鵬飛，蘇夢(mèng)翔，3，4*

（1中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京 210009；2揚(yáng)州一洋制藥有限公司，揚(yáng)州 225600；3藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中國(guó)藥科大學(xué)），南京 210009；4國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥物制劑及輔料研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009）

酰氯類化合物是藥物合成過程中重要的酰化劑。其代表性物質(zhì)氯乙酰氯（chloroacetyl chloride）具有極強(qiáng)的酰化能力，被廣泛運(yùn)用于農(nóng)藥及他達(dá)拉非、雙氯芬酸鈉等的合成中［1-3］。氯乙酰氯化學(xué)性質(zhì)極為活潑，遇水反應(yīng)生成氯乙酸。盡管目前尚未有足夠的證據(jù)證明氯乙酰氯和氯乙酸的基因毒性和致癌性，但其結(jié)構(gòu)中含有警示結(jié)構(gòu)——酰鹵基團(tuán)，因此這兩種成分為潛在的基因毒性雜質(zhì)［4］。

阿嗪米特（azintamide）是一種治療因膽汁分泌不足或消化酶缺乏而引起的癥狀的藥物［5-6］。氯乙酰氯是其合成的起始物料之一，因此有必要建立高靈敏度、專屬性強(qiáng)的痕量定量檢測(cè)方法來考察氯乙酰氯及其水解產(chǎn)物氯乙酸在阿嗪米特中的殘留量。因氯乙酰氯的高反應(yīng)活性和氯乙酸的強(qiáng)酸性，且缺乏檢測(cè)響應(yīng)結(jié)構(gòu)，二者都無法通過高效液相色譜或氣相色譜直接分析，故采取衍生化方法鈍化其活性及改善色譜行為，成為分析這兩種物質(zhì)的常用方法。目前有文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定酰氯類化合物較為常用的衍生化試劑主要有甲醇［7-9］、吖啶酮乙酰肼（熒光標(biāo)記試劑）［10］、苯肼類物質(zhì)［11］等，其中采用甲醇做衍生化試劑通過GC-MS 法測(cè)定的檢測(cè)限能達(dá)到0.01 μg/mL，采用不同的衍生化試劑通過HPLC 法測(cè)定的檢測(cè)限最低能達(dá)到0.02 μg/mL。氯乙酸是飲用水中的主要消毒劑副產(chǎn)物之一，針對(duì)檢測(cè)水樣中的鹵乙酸建立了GC、離子色譜（IC）、HPLC 及這些色譜法與電感耦合等離子體質(zhì)譜（MS/ICP）聯(lián)用的分析方法［12-13］。與水樣相比，藥物具有更加復(fù)雜的基質(zhì)，需要更靈敏、具有高度特異性的檢測(cè)方法。目前有文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定藥物中氯乙酸較為常用的衍生化試劑主要有1-萘胺［14］、苯肼類物質(zhì)［15］等，其檢測(cè)限最低能達(dá)到0.02 μg/mL。

本課題組前期建立了阿嗪米特中潛在基因毒性雜質(zhì)馬來酰肼的液相-熒光分析方法［16］。本文在此基礎(chǔ)上，建立了兩種以2-硝基苯肼為衍生化試劑的柱前衍生化HPLC 法，分別檢測(cè)阿嗪米特原料藥中氯乙酰氯和氯乙酸。反應(yīng)原理見圖1、圖2。所建立的方法與文獻(xiàn)相比，解決了衍生化反應(yīng)穩(wěn)定性的同時(shí)提高了檢測(cè)的靈敏度，氯乙酰氯和氯乙酸的檢測(cè)限分別為7.5 ng/mL和15 ng/mL。方法成功運(yùn)用于阿嗪米特原料藥中潛在基因毒雜質(zhì)氯乙酰氯和氯乙酸的檢測(cè)。

Figure 1 Overview of the reaction between 2-nitrophenylhydrazine and chloroacetyl chloride

Figure 2 Overview of the reaction between 2-nitrophenylhydrazine and chloroacetic acid

1 材 料

1.1 儀 器

1260 型高效液相色譜儀配紫外檢測(cè)器、Waters Empower網(wǎng)絡(luò)版工作站（美國(guó)安捷倫科技公司）；XPR10 型電子天平（瑞士梅勒特托利多公司）；MSE125P 型電子天平（德國(guó)Sartorius 公司）；PL5242 型超純水儀（美國(guó)Pall 公司）；Centrivap 真空離心濃縮儀（美國(guó)Labconco 公司）；MixMate 渦旋儀（德國(guó)Eppendorf 公司）；KH-3200DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

氯乙酰氯對(duì)照品（美國(guó)QCC 公司）；氯乙酸對(duì)照品（德國(guó)Sigma 公司）；阿嗪米特原料藥（批號(hào)：160003、160009、170004、170005、180010、180020、190001、190012、190023、190024、190025）（揚(yáng)州一洋制藥有限公司）；2-硝基苯肼［阿拉丁試劑（上海）有限公司］；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl，阿拉丁試劑有限公司）；1-羥基苯并三唑（HOBT，上海吉爾生化有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為市售分析純。

2 方 法

2.1 氯乙酰氯檢測(cè)

2.1.1 色譜條件 以Thermo syncronis C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以0.1%磷酸水-乙腈（74：26）（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～18 min，100%A；18～19 min，100%A→15%A；19 ～29 min，15%A；29 ～30 min，15%A→100%A；30～45 min，100%A）；柱溫40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)226 nm；流速1 mL/min；進(jìn)樣量50 μL。

2.1.2 溶液的配制

空白溶劑：取適量二氯甲烷于10 mL 量瓶，靜置反應(yīng)40 min后，取500 μL揮干，加入乙腈500 μL復(fù)溶，加入水500 μL，渦旋混勻后即得空白溶劑。

衍生化試劑：取2-硝基苯肼20 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加二氯甲烷適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每毫升含2-硝基苯肼2 mg 的2-硝基苯肼溶液。取適量二氯甲烷于10 mL量瓶，加入2-硝基苯肼溶液（2 mg/mL）100 μL，搖勻，加入二氯甲烷定容。靜置反應(yīng)40 min后，取500 μL揮干，加入乙腈500 μL復(fù)溶，加入水500 μL，渦旋混勻后即得空白衍生化試劑。

對(duì)照品溶液：加適量乙腈于1 mL量瓶中，精密稱定氯乙酰氯3 mg于量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到每毫升含氯乙酰氯3 mg的溶液。取上述溶液100 μL 于20 mL 量瓶，用二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，制成每毫升含氯乙酰氯15 μg 的氯乙酰氯溶液。

限度濃度對(duì)照品溶液：取適量二氯甲烷于10 mL 量瓶中，加入2-硝基苯肼溶液（2 mg/mL）100 μL，搖勻，加入上述對(duì)照品溶液100 μL 后，加入二氯甲烷定容。靜置反應(yīng)40 min 后，取500 μL揮干，加入乙腈500 μL 復(fù)溶，加入水500 μL，渦旋混勻后制成每毫升含氯乙酰氯150 ng 的限度濃度對(duì)照品溶液。

含限度濃度雜質(zhì)的供試品溶液：取阿嗪米特原料藥約500 mg，精密稱定，置于10 mL 量瓶中，加適量二氯甲烷超聲溶解，加入上述對(duì)照品溶液100 μL，搖勻，加入2-硝基苯肼溶液（2 mg/mL）100 μL 后，加入二氯甲烷定容。靜置反應(yīng)40 min后，取500 μL 揮干，加入乙腈500 μL 復(fù)溶，加入水500 μL，渦旋混勻后制成每毫升含氯乙酰氯150 ng的含限度濃度雜質(zhì)的供試品溶液。

供試品溶液：取阿嗪米特原料藥約500 mg，精密稱定，置于10 mL 量瓶中，加適量二氯甲烷超聲溶解，加入2-硝基苯肼溶液（2 mg/mL）100 μL，搖勻，加入二氯甲烷定容。靜置反應(yīng)40 min 后，取500 μL 揮干，加入乙腈500 μL 復(fù)溶，加入水500 μL，渦旋混勻后即得供試品溶液。

2.2 氯乙酸檢測(cè)

2.2.1 色譜條件 以Thermo syncronis C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以0.1%磷酸水-乙腈（72∶28）（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～18 min，100%A；18～19 min，100%A→15%A；19～29 min，15%A；29～30 min，15%A→100%A；30～40 min，100%A）；柱溫40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)226 nm；流速1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 溶液的配制

空白溶劑：乙腈-水（70∶30）。

衍生化試劑：取2-硝基苯肼約200 mg，精密稱定，置20 mL 量瓶中，加空白溶劑適量溶解并稀釋至刻度，得到每毫升含2-硝基苯肼10 mg 的2-硝基苯肼儲(chǔ)備液。取EDC·HCl約400 mg，精密稱定，置20 mL 量瓶中，加空白溶劑適量溶解并稀釋至刻度，得到每毫升含EDC·HCl 20 mg 的EDC·HCl 儲(chǔ)備液。取HOBT 約400 mg，精密稱定，置20 mL 量瓶中，加空白溶劑適量溶解并稀釋至刻度，得到每毫升含HOBT 20 mg的HOBT儲(chǔ)備液。取適量空白溶劑于10 mL 量瓶，加入2-硝基苯肼溶液（10 mg/mL）0.8 mL，EDC·HCl 溶液（20 mg/mL）0.25 mL，HOBT 溶液（20 mg/mL）0.25 mL，搖勻，加入空白溶劑定容，靜置反應(yīng)60 min后制成空白衍生化溶液。

對(duì)照品溶液：精密稱定氯乙酸20 mg 于20 mL量瓶中，用空白溶劑溶解并稀釋至刻度，得到每毫升含氯乙酸1 mg 的氯乙酸溶液。取上述溶液150 μL 于10 mL 量瓶，用70%乙腈稀釋至刻度，得到每毫升含氯乙酸15 μg的氯乙酸溶液。

限度濃度對(duì)照品溶液：取適量空白溶劑于10 mL 量瓶中，加入2-硝基苯肼溶液（10 mg/mL）0.8 mL，EDC·HCl 溶 液（20 mg/mL）0.25 mL，HOBT 溶液（20 mg/mL）0.25 mL，搖勻，加入上述對(duì)照品溶液100 μL后，加入空白溶劑定容，靜置反應(yīng)60 min 制成每毫升含氯乙酸150 ng 的限度濃度對(duì)照品溶液。

含限度濃度雜質(zhì)的供試品溶液：取阿嗪米特原料藥約500 mg，精密稱定，置于10 mL 量瓶中，加適量空白溶劑超聲溶解，加入2-硝基苯肼溶液（10 mg/mL）0.8 mL，EDC·HCl 溶 液（20 mg/mL）0.25 mL，HOBT 溶液（20 mg/mL）0.25 mL，搖勻，加入上述對(duì)照品溶液100 μL 后，加入空白溶劑定容，混勻后靜置反應(yīng)60 min 制成每毫升含氯乙酸150 ng的含限度濃度雜質(zhì)的供試品溶液。

供試品溶液：取阿嗪米特原料藥約500 mg，精密稱定，置于10 mL 量瓶中，加適量空白溶劑超聲溶解，加入2-硝基苯肼溶液（10 mg/mL）0.8 mL，EDC·HCl 溶 液（20 mg/mL）0.25 mL，HOBT 溶 液（20 mg/mL）0.25 mL，搖勻，加入空白溶劑定容，渦旋混勻后靜置反應(yīng)60 min即得供試品溶液。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

根據(jù)上述方法分別進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果顯示，空白溶劑、衍生化試劑及阿嗪米特均不干擾待測(cè)物質(zhì)出峰（圖3、圖4）；氯乙酰氯和氯乙酸的檢測(cè)限分別為7.5 ng/mL 和15 ng/mL，定量限均為30 ng/mL。在30 ～300 ng/mL范圍內(nèi)氯乙酰氯和氯乙酸的質(zhì)量濃度與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。線性回歸方程分別為y=471.3x-3 029.2（r=0.995 7）和y=239.81x+2.029 4（r=0.997 9）；加樣回收率在87.37%～109.75%范圍內(nèi)。進(jìn)樣精密度峰面積的RSD 分別為1.83%、0.98%；重復(fù)性含量的RSD 分別為4.25%、1.30%；中間精密度含量的RSD分別為13.77%、2.29%；溶液均在36 h內(nèi)穩(wěn)定；加樣回收率在87.37% ～109.75%范圍內(nèi)；方法耐用性良好。各項(xiàng)數(shù)據(jù)均符合驗(yàn)證方案要求，因此本研究建立的兩種方法適用于阿嗪米特原料藥。

3.2 樣品的測(cè)定

取11 批阿嗪米特原料藥，分別按“2.1.2”和“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”和“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并以外標(biāo)法計(jì)算氯乙酰氯和氯乙酸含量。結(jié)果顯示，11 批阿嗪米特原料藥中均未檢出氯乙酰氯和氯乙酸。

Figure 3 HPLC chromatograms of chloroacetyl chloride specificity tests1: Chloroacetyl chloride. A: Blank solution; B: Blank derivatization solution; C: Limit concentration reference solution; D: Test solution; E:Test solution containing limit concentration impurities

Figure 4 HPLC chromatograms of chloroacetic acid specificity tests2: Chloroacetic acid. A: Blank solution; B: Blank derivatization solution;C:Limit concentration reference solution;D:Test solution;E:Test solution containing limit concentration impurities

3.3 討 論

3.3.1 限度的確定 根據(jù)ICH M7（R1）中對(duì)多個(gè)致突變雜質(zhì)的可接受攝入量提出的規(guī)定，毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）的可接受攝入量適用于每個(gè)單雜，如果有兩個(gè)2 類或3 類雜質(zhì)，應(yīng)制定各自限度。對(duì)于臨床研發(fā)和已上市的藥品，如果原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有3 個(gè)或更多2 類或3 類雜質(zhì)，應(yīng)按照多個(gè)雜質(zhì)的可接受總攝入量制定總致突變雜質(zhì)限度［17］。盡管尚無充足證據(jù)證明氯乙酰氯和氯乙酸的致癌性，但其結(jié)構(gòu)中含有警示結(jié)構(gòu)“酰鹵基團(tuán)”，對(duì)非目標(biāo)生物的毒性尚未確定。因此本研究參考遺傳毒性雜質(zhì)的分類中第二類物質(zhì)使用TTC 分別對(duì)氯乙酰氯和氯乙酸進(jìn)行限度控制［17］，同時(shí)結(jié)合復(fù)方阿嗪米特說明書中每日最大劑量為450 mg，可得氯乙酰氯與氯乙酸的可接受限度=1.5（μg/d）/0.45（g/d）=3.33 μg/g。本研究將氯乙酰氯與氯乙酸的可接受限度分別定為3 μg/g。本研究所建立的兩種方法的檢測(cè)限分別為0.15 μg/g 和0.3 μg/g，遠(yuǎn)低于上述限度，通過本研究建立的方法對(duì)11 批阿嗪米特進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出氯乙酰氯和氯乙酸，表明11批阿嗪米特原料藥中的氯乙酰氯和氯乙酸的含量均低于檢測(cè)限，滿足限度控制的要求。

3.3.2 檢測(cè)方法的優(yōu)化與確定 預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，文獻(xiàn)中檢測(cè)氯乙酰氯時(shí)選用乙腈作為反應(yīng)溶劑［11］，乙腈與水混溶而氯乙酰氯極易與水反應(yīng)，準(zhǔn)確度無法滿足要求。本研究選擇二氯甲烷作為反應(yīng)溶劑，優(yōu)化了衍生化反應(yīng)體系?？疾炝搜苌噭?-硝基苯肼的用量及衍生化反應(yīng)時(shí)間，為保證反應(yīng)完全最終選定的最佳條件是在2-硝基苯肼的質(zhì)量濃度為20 μg/mL 進(jìn)行反應(yīng)40 min。此外，研究發(fā)現(xiàn)復(fù)溶溶劑乙腈與水的比例對(duì)氯乙酰氯的峰形及響應(yīng)產(chǎn)生影響：水相比例增大時(shí)色譜峰的響應(yīng)變差（可能產(chǎn)物發(fā)生了水解），有機(jī)相比例增加時(shí)色譜峰峰形變差，經(jīng)權(quán)衡優(yōu)化最終選定乙腈-水（50∶50）作為復(fù)溶溶劑。

本課題組前期在研究氯乙酸時(shí)，采取與氯乙酰氯相同的衍生化方法進(jìn)行檢測(cè)未能夠得到目標(biāo)產(chǎn)物；參考文獻(xiàn)在衍生化反應(yīng)中加入縮合劑（EDC·HCl）檢測(cè)氯乙酸［15］時(shí)，發(fā)現(xiàn)得到的衍生化產(chǎn)物量很少，紫外響應(yīng)差，通過調(diào)整反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、反應(yīng)物比例等均未得到改善。本研究在加入酰化催化劑（HOBT）后使得該衍生化反應(yīng)效率大幅提高，并且避免了副產(chǎn)物的產(chǎn)生。對(duì)反應(yīng)物比例及反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，確定了衍生化試劑、縮合劑及酰化催化劑比例為8∶5∶5，反應(yīng)時(shí)間為60 min。

本研究建立的兩種方法中的兩待測(cè)物氯乙酰氯和氯乙酸的結(jié)構(gòu)相近，且衍生化反應(yīng)產(chǎn)物相同，考慮到氯乙酰氯在氯乙酸衍生化的條件下反應(yīng)并可能產(chǎn)生干擾，筆者曾試過氯乙酰氯在氯乙酸衍生化的條件下的衍生化反應(yīng)，得到了相同的衍生化產(chǎn)物。原因如下：氯乙酸的衍生化反應(yīng)體系中含水，氯乙酰氯遇水先迅速轉(zhuǎn)變?yōu)槁纫宜岷?，再與衍生化試劑繼續(xù)反應(yīng)，得到相同的衍生化反應(yīng)產(chǎn)物。因此，反應(yīng)并不干擾兩者的測(cè)定。嚴(yán)格來講，氯乙酸的衍生化測(cè)定結(jié)果包含了氯乙酰氯和氯乙酸的殘留總量，而氯乙酰氯的衍生化方法僅檢測(cè)氯乙酰氯。

本研究分別建立了兩種不同的柱前衍生化HPLC-UV 方法檢測(cè)阿嗪米特原料藥中基因毒性雜質(zhì)氯乙酰氯和氯乙酸，以3 μg/g為限度完成了完整的方法學(xué)驗(yàn)證及測(cè)樣。方法學(xué)結(jié)果顯示，本研究建立的兩種方法靈敏度高、專屬性好，能夠準(zhǔn)確測(cè)定阿嗪米特原料藥中的氯乙酰氯和氯乙酸，可以為阿嗪米特原料藥的質(zhì)量控制提供參考。