譚睿陟 鐘霞 王麗 楊思進(jìn) 徐厚平

關(guān)鍵詞蛭龍活血通瘀膠囊;腦出血;炎癥;長鏈非編碼RNA;轉(zhuǎn)錄組測序

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是常見的腦卒中類型之一，發(fā)病率僅次于腦梗死，具有極高的致殘率和致死率[1]。據(jù)研究統(tǒng)計(jì)，患者腦卒中后1 年的病死率接近60%，僅有20%的患者在腦卒中6 個(gè)月后能存活并獨(dú)立生活[2]，且男性發(fā)病率遠(yuǎn)高于女性[3]?？梢姡X卒中已嚴(yán)重威脅患者的生命安全，影響患者及其家屬的生活質(zhì)量。ICH 由腦組織出血引起，并可由高血壓、動(dòng)靜脈畸形或頭部外傷導(dǎo)致，其病理生理學(xué)特征為嚴(yán)重的炎癥、鐵毒性、水腫、氧化應(yīng)激和凝血酶形成[4]。蛭龍活血通瘀膠囊由水蛭、地龍、大血藤、黃芪、桂枝等藥材組成，是西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院研制的院內(nèi)制劑，被廣泛用于ICH 的臨床治療，效果明顯[5-6]。此外，多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究亦發(fā)現(xiàn)，蛭龍活血通瘀膠囊能有效改善大鼠/小鼠ICH 導(dǎo)致的腦損傷，具有顯著的腦保護(hù)作用[7-9]。然而，蛭龍活血通瘀膠囊干預(yù)ICH 的具體作用機(jī)制尚不明確。近年來研究發(fā)現(xiàn)，部分長鏈非編碼RNA（longnon-coding RNA，LncRNA）參與了染色體沉默、基因組印記、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷鄠€(gè)重要的調(diào)控過程[10-12]，且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中扮演關(guān)鍵角色，如誘導(dǎo)ICH 后細(xì)胞自噬和神經(jīng)炎癥[13]。本研究擬采用尾狀核注射膠原酶以建立ICH小鼠模型，先考察蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)小鼠ICH的影響，再通過轉(zhuǎn)錄組測序分析差異LncRNA并進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）富集，預(yù)測有效LncRNA 和靶基因，最后通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，旨在為明確蛭龍活血通瘀膠囊改善ICH后腦損傷的作用機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括LightCycler480 Ⅱ型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（瑞士Roche 公司），Mini-Protein Tetra System 型蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、ChemiDoc XRS+型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司），RM2255 型組織切片系統(tǒng)（德國Leica 公司），BX61VS型全自動(dòng)虛擬切片掃描系統(tǒng)（日本Olympus 公司），NanoDrop 2000 型超微量分光光度計(jì)（美國Thermo Fisher Scientific公司）等。

1.2 主要藥品和試劑

蛭龍活血通瘀膠囊（批號(hào)20180216，規(guī)格0.4 g/粒）由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室制備;Ⅶ型膠原酶（批號(hào)C0773）購自美國Sigma 公司;cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑（批號(hào)R323-01）、熒光定量PCR 試劑（批號(hào)Q711-03）均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;蘇木精-伊紅染色試劑盒（批號(hào)C0105）和尼氏染色試劑盒（批號(hào)C0117）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;免疫組化試劑盒（批號(hào)PV-9000）和3，3′- 二氨基聯(lián)苯胺（批號(hào)ZLI-9017）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;小鼠白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體（批號(hào)分別為sc-52012、sc-52746、sc-365062）均購自美國Santa Cruz 公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白G二抗（批號(hào)31430）和Trizol 總RNA抽提試劑（批號(hào)15596026）均購自美國Invitrogen 公司;考馬斯亮藍(lán)（批號(hào)B104237）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;SuperSignalTM West Pico PLUS 高敏發(fā)光液（批號(hào)pierce34580）購自美國Thermo Fisher Scientific 公司;其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6 小鼠33 只，8 周齡，購自成都藥康生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（川）-2020-034。所有小鼠均飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房內(nèi)，溫度為20～22 ℃，相對(duì)濕度為50%～60%，12 h/12 h明暗交替。本實(shí)驗(yàn)方案已通過西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，審批編號(hào)為20211111-002。

2 方法

2.1 造模

小鼠經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后，頭部向上固定于腦立體定位儀上，于前囟區(qū)域備皮，用75%乙醇消毒，縱向剪開該處皮膚約1 cm，用3%過氧化氫除去骨膜并暴露前囟及右側(cè)顱骨，定位右側(cè)尾狀核（前囟右2.5mm，前囟前左側(cè)0.2 mm），鉆孔，注射0.075 U/μL Ⅶ型膠原酶溶液1 μL，進(jìn)針深度為3 mm，5 min 注射完畢，留針5 min 后以1 mm/min 緩慢出針，骨蠟封閉進(jìn)針孔，縫合皮膚并消毒。實(shí)驗(yàn)過程中保持室溫（25±2）℃。術(shù)后24 h，待小鼠清醒后進(jìn)行改良的神經(jīng)功能缺損評(píng)分（modified neurological severity score，mNSS），若mNSS評(píng)分≥7 分則提示建模成功[14]。

2.2 分組、給藥與采樣

2.2.1 藥效學(xué)觀察將24 只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為假手術(shù)1 組、模型1 組和蛭龍活血通瘀膠囊低、高劑量組[0.35、1.40 g/kg，以水為溶劑，劑量根據(jù)成人日劑量（0.08 g/kg）換算并結(jié)合多次動(dòng)物預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置]，每組6 只。模型1 組和各藥物組小鼠按“2.1”項(xiàng)下方法復(fù)制ICH 模型，假手術(shù)1 組小鼠除不注射膠原酶外其余操作同“2.1”項(xiàng)。術(shù)后1 h，各藥物組小鼠灌胃相應(yīng)藥液，假手術(shù)1 組和模型1 組小鼠灌胃生理鹽水，每天1 次，連續(xù)3d。末次給藥后，小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，經(jīng)心臟采血處死后迅速分離大腦，并提取ICH血腫周圍組織。血液樣品于室溫下放置1 h 后，以3 000 r/min 離心15 min，分離血清。腦組織分為兩部分，一部分用4%多聚甲醛溶液固定，用于后續(xù)形態(tài)學(xué)觀察和免疫組化實(shí)驗(yàn);另一部分凍存于-20 ℃冰箱中，用于后續(xù)RNA和蛋白表達(dá)檢測。

2.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序?qū)⑹Ｓ嗟? 只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為假手術(shù)2 組、模型2 組和干預(yù)組（蛭龍活血通瘀膠囊1.40 g/kg，選擇藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)中改善效果較好的劑量），每組3 只。小鼠造模和給藥同“2.2.1”項(xiàng)。末次給藥后，小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，經(jīng)心臟采血處死后迅速分離全腦組織。將全腦組織快速凍存于液氮中，一部分用干冰保存寄往廣州基迪奧生物科技有限公司，以提取高質(zhì)量RNA并進(jìn)行測序;另一部用于實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。

2.3 小鼠腦組織形態(tài)學(xué)觀察

取“2.2.1”項(xiàng)下固定于4%多聚甲醛溶液中的腦組織適量，常規(guī)石蠟包埋，切片（厚度4 μm），經(jīng)脫蠟、復(fù)水后用蘇木精-伊紅染料（蘇木精染色5 min，伊紅染色40 s）、尼氏染料（染色1 h）染色，晾干后用中性樹膠封片。使用全自動(dòng)虛擬切片掃描系統(tǒng)觀察各組小鼠的腦組織形態(tài)學(xué)變化。

2.4 小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α表達(dá)的檢測

采用免疫組化法進(jìn)行檢測。取“2.2.1”項(xiàng)下固定于4%多聚甲醛溶液中的腦組織適量，常規(guī)石蠟包埋，切片（厚度4 μm），經(jīng)脫蠟后用檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）微波修復(fù)抗原，以5%胎牛血清室溫封閉30 min，隨后滴加IL-1β、TNF-α一抗（稀釋比例均為1 ∶ 200），4 ℃孵育過夜;再滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h 后，使用3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（稀釋20 倍）顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，晾干后用中性樹膠封片。使用全自動(dòng)虛擬切片掃描系統(tǒng)采集圖片并評(píng)估IL-1β、TNF-α表達(dá)情況，陽性細(xì)胞被染成棕色，棕色越深即表達(dá)越強(qiáng)。

2.5 小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)的檢測

采用Western blot 法進(jìn)行檢測。取“2.2.1”項(xiàng)下凍存的腦組織適量，液氮研磨后加入RIPA裂解液冰上孵育30 min，超聲（功率200 W，頻率20 kHz）處理2 s×5 次;以13 000 r/min 離心10 min，取上清液，用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。取100 ℃加熱變性的蛋白70 μg 進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，100 V轉(zhuǎn)膜60 min 后將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜上，用5%胎牛血清室溫封閉1 h，分別加入IL-1β、TNF-α一抗（稀釋比例均為1 ∶1 000）和GAPDH一抗（稀釋比例為1 ∶5 000），4 ℃孵育過夜;隨后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白G二抗（稀釋比例為1 ∶5 000），室溫孵育1 h，用高敏發(fā)光液浸泡30 s 后置于凝膠成像系統(tǒng)下成像。使用Image J V1.8.0 軟件分析蛋白的條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α mRNA和有效LncRNA及靶基因表達(dá)的檢測

采用實(shí)時(shí)定量PCR 法進(jìn)行檢測。取“2.2.1”項(xiàng)下凍存或“2.2.2”項(xiàng)下液氮中的腦組織適量，液氮研磨后加入Trizol 總RNA抽提試劑提取總RNA。使用超微量分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度后，每個(gè)樣本取RNA 1 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以制備相應(yīng)的cDNA。cDNA經(jīng)無酶水40 μL稀釋后，采用基于SYBR green 體系的PCR 試劑進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系（10 μL）包含上/下游引物各0.5 μL、2×擴(kuò)增試劑5 μL、cDNA模板1 μL、無酶水3 μL。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，共40 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及產(chǎn)物長度見表1。

2.7 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)處理

為保證數(shù)據(jù)質(zhì)量，需要在信息分析之前對(duì)原始的RNA數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和過濾，以減少無效數(shù)據(jù)對(duì)結(jié)果造成的干擾。本研究利用Fastp 軟件對(duì)測序得到的原始數(shù)據(jù)（raw reads）進(jìn)行質(zhì)量分析，過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)[15];利用R V4.0.4 軟件“DESeq2 包”篩選高質(zhì)量數(shù)據(jù)中的差異LncRNA，標(biāo)準(zhǔn)為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）<0.05 且|樣品間表達(dá)量比值[log2（FC）]|>1[16];根據(jù)差異LncRNA與其鄰近蛋白編碼基因相關(guān)（順式mRNA），或差異LncRNA與其共表達(dá)的蛋白編碼基因相關(guān)（反式mRNA）分析得到與差異LncRNA 關(guān)聯(lián)的順式或反式mRNA[17];將順式或反式mRNA數(shù)據(jù)導(dǎo)入GO數(shù)據(jù)網(wǎng)站（http：//geneontology.org）進(jìn)行功能分類并富集，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)找出與整個(gè)基因組背景相比顯著富集的GO條目;利用R V4.0.4 軟件“熱圖（heat map）包”對(duì)差異LncRNA表達(dá)模式進(jìn)行層級(jí)聚類分析，并使用熱圖呈現(xiàn)聚類結(jié)果。蛭龍活血通瘀膠囊干預(yù)相關(guān)有效LncRNA的篩選標(biāo)準(zhǔn)如下：在模型2 組中找出與假手術(shù)2 組相比有顯著差異的LncRNA，且其在干預(yù)組中的表達(dá)相對(duì)于模型組有明顯改善，此LncRNA即為蛭龍活血通瘀膠囊干預(yù)ICH相關(guān)的有效LncRNA。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)ICH模型小鼠腦組織形態(tài)的影響

蘇木精-伊紅染色結(jié)果（圖1）顯示，與假手術(shù)1 組比較，模型1 組小鼠腦組織病理損傷嚴(yán)重，細(xì)胞間隙增大、排列紊亂;與模型1 組比較，蛭龍活血通瘀膠囊低、高劑量組小鼠腦組織病理損傷均有所減輕，其中高劑量組的改善效果更明顯。尼氏染色結(jié)果（圖1）顯示，與假手術(shù)1組比較，模型1 組小鼠神經(jīng)元大量減少，腦神經(jīng)損壞嚴(yán)重;與模型1 組比較，蛭龍活血通瘀膠囊低、高劑量組小鼠神經(jīng)元均有所恢復(fù)，其中高劑量組恢復(fù)更佳。

3.2 蛭龍活血通瘀膠囊對(duì)ICH模型小鼠腦組織中炎癥因子IL-1β和TNF-α表達(dá)的影響

3.2.1 免疫組化法模型1 組小鼠腦組織中IL-1 β和TNF-α的表達(dá)水平均高于假手術(shù)1 組，而蛭龍活血通瘀膠囊低、高劑量組小鼠腦組織中IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平均低于模型1 組。結(jié)果見圖2。

3.2.2 Western blot 法與假手術(shù)1 組比較，模型1 組小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P<0.05）;與模型1 組比較，蛭龍活血通瘀膠囊低、高劑量組小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）。結(jié)果見圖3、圖4。

3.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR 法與假手術(shù)1 組比較，模型1 組小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P<0.05）;與模型1 組比較，蛭龍活血通瘀膠囊低、高劑量組小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）。結(jié)果見圖5。

3.3 轉(zhuǎn)錄組測序樣本RNA質(zhì)量分析

除去含數(shù)據(jù)接頭（adapter）序列、含未知堿基比例大于10%序列、全部都是A堿基序列以及低質(zhì)量序列數(shù)據(jù)后，所得有效數(shù)據(jù)（clean data）占比均高于99%，表明數(shù)據(jù)質(zhì)量佳。結(jié)果見表2。

3.4 差異LncRNA分析

假手術(shù)2 組與模型2 組比較，有44 個(gè)差異LncRNA，包括顯著上升的LncRNA 25 個(gè)、顯著下降的LncRNA 19個(gè);而模型2 組與干預(yù)組比較，有16 個(gè)差異LncRNA，包括顯著上升的LncRNA 8 個(gè)、顯著降低的LncRNA 8 個(gè)。結(jié)果見圖6。

3.5 GO富集

差異LncRNA 與順式mRNA關(guān)聯(lián)的相關(guān)功能主要集中在生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞進(jìn)程、生物進(jìn)程陽性調(diào)節(jié)、發(fā)育進(jìn)程等方面，顯著富集的GO條目見圖7A;差異LncRNA與反式mRNA關(guān)聯(lián)的相關(guān)功能主要集中在刺激響應(yīng)、代謝調(diào)節(jié)、免疫進(jìn)程等方面，顯著富集的GO條目見圖7B。

3.6 有效LncRNA分析

篩選到1 個(gè)LncRNA 在模型2 組中表達(dá)較假手術(shù)2組更高，且經(jīng)蛭龍活血通瘀膠囊干預(yù)后顯著下調(diào)，經(jīng)數(shù)據(jù)庫（http：//asia.ensembl.org）查詢發(fā)現(xiàn)其為LncRNADlst-211，其靶基因?yàn)閞ibosomal protein S6 kinase-like 1（Rps6kl1）。此外，還發(fā)現(xiàn)LncRNA-MSTRG.8169.4 在模型2 組中低表達(dá)，而經(jīng)蛭龍活血通瘀膠囊干預(yù)后顯著上調(diào)。聚類分析結(jié)果見圖8。

3.7 有效LncRNA的PCR驗(yàn)證

與假手術(shù)2組比較，模型2組小鼠腦組織中Lnc RNADlst-211 的相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P<0.05），Rps6kl1、LncRNA-MSTRG.8169.4 的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）。與模型2 組比較，干預(yù)組小鼠腦組織中LncRNADlst-211 的相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P<0.05），Rps6kl1、LncRNA-MSTRG.8169.4 的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P<0.05）。結(jié)果見圖9。

4 討論

ICH 是一種發(fā)病率高、致殘率高、致死率高、復(fù)發(fā)率高的腦血管疾病，好發(fā)于中老年人群，嚴(yán)重威脅人們的生命安全和生活質(zhì)量[18]。現(xiàn)有研究表明，高血壓和淀粉樣腦血管病是原發(fā)性ICH 的主要發(fā)病原因;除此以外，顱內(nèi)動(dòng)脈瘤、動(dòng)脈硬化等也是ICH 的發(fā)病原因之一[19]。ICH 發(fā)病會(huì)造成腦組織局部占位性病變，同時(shí)釋放大量凝血酶，并激活損傷相關(guān)分子模式從而釋放出大量炎癥因子和補(bǔ)體因子，進(jìn)而誘導(dǎo)腦組織炎癥反應(yīng)、免疫細(xì)胞浸潤和腦細(xì)胞凋亡[20]。盡管針對(duì)原發(fā)性ICH 損傷的手術(shù)已可以減輕神經(jīng)功能損傷并降低病死率，但是ICH患者的預(yù)后依然不佳[21]。因此，減輕ICH 誘導(dǎo)的炎癥和繼發(fā)性腦損傷成為目前ICH臨床治療的主要方向。

中醫(yī)認(rèn)為，中風(fēng)（腦卒中）發(fā)生多因風(fēng)、火、痰、瘀、氣、虛等導(dǎo)致人體氣血陰陽運(yùn)行失常、臟腑功能失調(diào)，故中醫(yī)治療注重祛風(fēng)、補(bǔ)氣、化痰、活血[22-23]。根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，我院楊思進(jìn)教授結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論提出補(bǔ)氣通絡(luò)、活血化瘀、化痰祛風(fēng)的腦血管疾病治療方法，并組方蛭龍活血通瘀膠囊。該方主要包含黃芪、水蛭、地龍、大血藤、桂枝等藥材，被廣泛用于腦卒中的臨床治療，并取得了良好的療效[24]。本研究結(jié)果也證實(shí)，蛭龍活血通瘀膠囊能顯著改善ICH模型小鼠的腦損傷，促進(jìn)其腦神經(jīng)功能恢復(fù)，同時(shí)能有效降低小鼠腦組織中炎癥因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)，減輕繼發(fā)性腦損傷，符合目前ICH臨床治療的抗二次損傷策略。

LncRNA 是一種不具備蛋白質(zhì)編碼能力的非編碼RNA，其長度超過200 個(gè)核苷酸[25]。已有研究證實(shí)，LncRNA能參與表觀遺傳介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、RNA代謝、細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡等進(jìn)程[26]，能調(diào)節(jié)神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞炎癥[27]，還與脊髓損傷以及神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生有關(guān)[28]?；诖耍狙芯渴占锡埢钛瞿z囊干預(yù)前后的腦組織，快速提取總RNA后采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對(duì)各組差異LncRNA 予以甄別。結(jié)果顯示，模型2 組和假手術(shù)2 組比較，有44 個(gè)差異LncRNA;模型2組和干預(yù)組比較，有16個(gè)差異LncRNA;通過進(jìn)一步篩選發(fā)現(xiàn)了2 個(gè)有效LncRNA，即LncRNADlst-211 和LncRNA-MSTRG.8169.4。筆者通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，LncRNA-Dlst-211 有順式作用靶基因。順式作用靶基因預(yù)測基本原理認(rèn)為，LncRNA 的功能與其鄰近的蛋白編碼基因相關(guān)，位于上游的LncRNA 可能與啟動(dòng)子或者共表達(dá)基因的其他順式作用元件有交集，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄時(shí)或者轉(zhuǎn)錄后對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[29]。LncRNA-Dlst-211 的順式靶基因可能為Rps6kl1，該基因與腦神經(jīng)發(fā)育相關(guān)，在腦部及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中呈高表達(dá)[30]。本研究在假手術(shù)2 組、模型2 組和干預(yù)組小鼠腦組織中檢測這兩個(gè)差異LncRNA（LncRNA-Dlst-211 和LncRNA-MSTRG.8169.4）以及LncRNA-Dlst-211 靶基因Rps6kl1 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，PCR驗(yàn)證結(jié)果與測序結(jié)果一致，即LncRNA-Dlst-211 在模型2 組中的表達(dá)升高，在干預(yù)組中的表達(dá)顯著降低，其靶基因Rps6kl1 的表達(dá)與之相反;而LncRNA-MSTRG.8169.4 在模型2 組中的表達(dá)降低，在干預(yù)組中的表達(dá)顯著升高。

綜上所述，蛭龍活血通瘀膠囊能改善ICH 模型小鼠的腦損傷，并減輕炎癥反應(yīng);其作用機(jī)制可能與下調(diào)LncRNA-Dlst-211的表達(dá)，上調(diào)LncRNA-MSTRG.8169.4、Rps6kl1的表達(dá)有關(guān)。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序分析了蛭龍活血通瘀膠囊干預(yù)后的差異LncRNA 以及其靶基因，并在體內(nèi)進(jìn)行了驗(yàn)證。后續(xù)筆者將進(jìn)一步檢測差異LncRNA在腦組織中表達(dá)的細(xì)胞種類，并探討其在蛭龍活血通瘀膠囊改善ICH 損傷中的潛在分子機(jī)制。本研究有助于從非編碼RNA 水平闡明復(fù)方蛭龍活血通瘀膠囊改善ICH 的表觀遺傳機(jī)制，為中藥干預(yù)ICH 的研究開拓了新的思路，為中藥藥理研究提供了基礎(chǔ)科學(xué)依據(jù)。