張宇航 陳旺 馮自立 袁洪超 高小林 王翠萍

關(guān)鍵詞淫羊藿;黃酮苷類化合物;低糖苷類化合物;生物轉(zhuǎn)化

淫羊藿（Epimedii Folium）是我國傳統(tǒng)中藥材，2020年版《中國藥典》（一部）收錄的淫羊藿品種有淫羊藿Epimediumbrevicornum Maxim.、柔毛淫羊藿E. pubescensMaxim.、箭葉淫羊藿E. sagittatum（Sieb. et Zucc.）Maxim.、朝鮮淫羊藿E. koreanum Nakai 4 個品種，具有滋補腎陽、祛除風濕、強壯筋骨等藥理作用[1-2]。黃酮苷類化合物是淫羊藿及其同屬植物的主要活性成分，通常可根據(jù)其黃酮母核上的糖基數(shù)目分為多糖苷類化合物（含3 個及以上糖基）朝藿定A、朝藿定B、朝霍定C和低糖苷類化合物（含2 個或1 個糖基）淫羊藿苷或?qū)氜杰闸馵3]。研究表明，淫羊藿低糖苷類化合物具有類雌激素和抗氧化等多種藥理作用，且活性強于多糖苷類化合物，這主要是由于低糖苷類化合物在人體內(nèi)的生物利用度較多糖苷類化合物更優(yōu)[4-7]?？梢?，黃酮苷類化合物糖鏈的多寡在很大程度上影響了該類化合物的生物活性。但淫羊藿及其同屬植物中高活性低糖苷類化合物的含量通常較低，不能通過常規(guī)分離純化的方法大量制備[8-9]。基于此，本研究對淫羊藿黃酮苷類化合物生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的研究進展進行綜述，旨在為該類化合物的制備提供參考。

1 酶水解法制備淫羊藿低糖苷類化合物

已有大量文獻報道，淫羊藿苷、朝霍定A、朝霍定B和朝霍定C可被蝸牛酶依次水解為寶藿苷Ⅰ或淫羊藿苷元、箭藿苷A、箭藿苷B和鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ，淫羊藿苷可被纖維素酶轉(zhuǎn)化為寶藿苷Ⅰ[10-13]。上述方法可用于制備淫羊藿低糖苷類化合物，但存在酶不能重復(fù)利用的問題，導致生產(chǎn)成本較高，故并不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。為了進一步改善上述問題，彭靜等[14]以海藻酸鋇為載體，通過交聯(lián)-包埋法對蝸牛酶進行固定，以朝藿定A、朝藿定B、朝霍定C和淫羊藿苷為底物進行水解，水解轉(zhuǎn)化率可達75.52%;經(jīng)5 次重復(fù)使用后，固定化蝸牛酶的活性還可保持在原來的50%，表明該工藝在通過酶水解制得低糖苷類化合物的同時，實現(xiàn)了對酶的重復(fù)利用，但存在載體機械強度低、在高溫和酸性條件下長時間攪拌容易吸水溶脹甚至破裂等不足。Liu 等[15]改善了酶的固定化方法，以二氧化硅為載體固定蝸牛酶，在水解淫羊藿苷和總黃酮時，酶重復(fù)利用6 次后，仍保持了60%的酶活力，其pH和熱穩(wěn)定性、底物濃度及酶穩(wěn)定性均得到了較好的提升;同時該研究還發(fā)現(xiàn)，淫羊藿總黃酮的水解產(chǎn)物具有明顯的抗腫瘤作用。

蝸牛酶中含有大量的纖維素酶，而纖維素酶的主要成分為β-葡萄糖苷酶，后者能夠水解β-葡萄糖苷鍵，通過除去β-葡萄糖基來獲得剩余黃酮母核[16]。因此，β-葡萄糖苷酶很可能是纖維素酶和蝸牛酶水解淫羊藿黃酮苷C7 位葡萄糖基的主要作用酶。研究表明，纖維素酶和β-葡萄糖苷酶均可將淫羊藿苷水解為寶藿苷Ⅰ，但低濃度纖維素酶的專一性較差，容易生成副產(chǎn)物;而β-葡萄糖苷酶的水解率和定向轉(zhuǎn)化率均接近100%，具有較高的效率和較強的專一性。這基本證明了β-葡萄糖苷酶是水解淫羊藿黃酮苷C7 位葡萄糖基的主要作用酶[17-20]。劉聰燕等[21]以殼聚糖交聯(lián)介孔納米二氧化硅為載體進行β-葡萄糖苷酶的固定，并將該酶重復(fù)用于淫羊藿苷的高效水解以制備寶藿苷Ⅰ，該研究也同樣證實了β-葡萄糖苷酶對淫羊藿黃酮苷C7 位葡萄糖基的高選擇性和水解的高效性。淫羊藿多糖苷類化合物在被β-葡萄糖苷酶水解的過程中會脫去C7 位上的葡萄糖基，故在水解完成后會生成低糖苷類化合物和葡萄糖。為了進一步獲得純度較高的低糖苷類化合物，避免后續(xù)煩瑣的分離純化操作，提高反應(yīng)效率及節(jié)約成本，汪燕等[22]和Shen等[23-25]構(gòu)建了清潔、高效的新型雙相酶水解體系，該體系集水解、分離純化為一體，基于脂溶性有機溶劑與緩沖液互不相溶且產(chǎn)物更易溶于有機溶劑的特點，以乙酸乙酯為有機相，以β-葡萄糖苷酶、底物和緩沖液等為水相，在短時間內(nèi)將高濃度的黃酮苷類化合物淫羊藿苷、朝藿定A和朝藿定B分別水解為相應(yīng)產(chǎn)物（轉(zhuǎn)化率均在98%以上，有機相轉(zhuǎn)移率超過95%），反應(yīng)結(jié)束后將有機層濃縮干燥，即可獲得高純度的低糖苷類化合物，同時緩沖液中的酶可被多次重復(fù)利用。該工藝在簡化操作步驟的同時，提高了反應(yīng)效率，避免了后續(xù)煩瑣的分離純化過程;同時，該工藝對設(shè)備要求低，比較適合于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。

α-L-鼠李糖苷酶可特異性地作用于α-1，2、α-1，3、α-1，4、α-1，6 糖苷鍵，通過除去α-L-鼠李糖基來獲得新的糖苷類化合物[26]。研究表明，在最優(yōu)酶水解條件下，朝藿定C可被α-L-鼠李糖苷酶特異性水解脫去C3 位上的鼠李糖基轉(zhuǎn)化為淫羊藿苷，但只有在底物濃度為100～200 μg/mL 的條件下才能實現(xiàn)完全水解[27-28]。Lyu 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在大腸埃希菌中表達的重組α-L-鼠李糖苷酶可使朝藿定C高效轉(zhuǎn)化為淫羊藿苷，在最優(yōu)水解條件下底物濃度有所提高但也只能達到1 mg/mL，且酶不能重復(fù)利用。該研究也同樣證實了α-L-鼠李糖苷酶對淫羊藿黃酮苷C3 位鼠李糖基的高選擇性。由此可見，α-L-鼠李糖苷酶主要作用于淫羊藿黃酮苷類化合物C3 位上的鼠李糖基，將朝藿定C水解為淫羊藿苷。目前，該工藝仍處于實驗室研究階段，通過該酶水解淫羊藿多糖苷類化合物來制備低糖苷類化合物，還需進一步通過酶工程等技術(shù)構(gòu)建高效的水解體系，解決水解效率低和酶重復(fù)利用性差等問題。

綜上，淫羊藿苷和朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C可分別被不同的酶水解為寶藿苷Ⅰ或苷元、箭藿苷A、箭藿苷B和淫羊藿苷或鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ，其水解途徑及產(chǎn)物見圖1。

2 微生物轉(zhuǎn)化法制備淫羊藿低糖苷類化合物

微生物細胞中存在的酶種類較多，且具有較好的糖苷類化合物轉(zhuǎn)化潛力[30]。經(jīng)發(fā)酵轉(zhuǎn)化后脫去的糖可作為微生物生長繁殖所需的碳源，從而代謝生成更多的酶，因此微生物發(fā)酵法也被廣泛應(yīng)用于多糖苷類化合物的結(jié)構(gòu)修飾領(lǐng)域[31]。

研究表明，短刺小克銀漢霉菌Cunninghamellablakesleana、平菇Pleurotus ostreatus、鏈球菌Streptococcussp. MRG-ICA-B、腸球菌Enterococcus sp. MRG-ICA-E、布勞特氏菌Blautia sp. MRG-PMF-1 及大鼠腸道菌群均可將淫羊藿黃酮苷類化合物母核C7 位上的葡萄糖基水解代謝，生成含有鼠李糖基的次級苷類化合物，如短刺小克銀漢霉菌可將朝藿定A、朝藿定B、朝霍定C、淫羊藿苷及淫羊藿苷A依次代謝為箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、寶藿苷Ⅰ及寶藿苷Ⅱ，其中大鼠腸道菌群不僅可將淫羊藿苷水解為寶藿苷Ⅰ，而且可把具有與寶藿苷Ⅰ相同母核結(jié)構(gòu)的化合物轉(zhuǎn)化為寶藿苷Ⅰ;平菇發(fā)酵液可將淫羊藿苷A代謝生成寶藿苷Ⅱ;淫羊藿苷與鏈球菌、腸球菌孵育后僅生成了寶藿苷Ⅰ，提示上述兩種菌對淫羊藿黃酮苷類化合物母核C7 位上的葡萄糖基具有較好的區(qū)域選擇性[32 - 35]。Cheng 等[36]和楊宇等[37]分別對綠色木霉Trichoderma viride 和柱孢梨頭霉菌Absidia sp. E9r 的菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)兩者均可分離純化出一種酶，將淫羊藿苷水解為寶霍苷Ⅰ，在隨后進行的鑒定中將這種酶鑒定為β-葡萄糖苷酶。常景玲等[38]研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿自生菌發(fā)酵液經(jīng)超聲處理后，可促進細胞內(nèi)有效酶的釋放，提高淫羊藿苷的生物轉(zhuǎn)化效率。這一方面體現(xiàn)出微生物在天然多糖苷類化合物結(jié)構(gòu)修飾方面的能力，另一方面也證明了酶是微生物進行代謝轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵組分。淫羊藿黃酮苷類化合物微生物轉(zhuǎn)化途徑及產(chǎn)物見圖2。

3 植物細胞轉(zhuǎn)化法制備淫羊藿低糖苷類化合物

與微生物轉(zhuǎn)化不同的是，植物細胞中通常存在多種微生物體內(nèi)不具備的特異酶，可催化某些反應(yīng)而生成多種復(fù)雜或新型的化合物[39]。因此，植物細胞中的酶對黃酮苷類藥物的開發(fā)具有極大的潛力。Feng 等[40]從淫羊藿屬植物E. pseudowushanense B. L.中分離純化出一種具有高選擇性的鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶（EpPf3rt），以淫羊藿苷元為基礎(chǔ)區(qū)域，特異性催化其母核C3 位上的鼠李糖基發(fā)生糖基化反應(yīng)，生物合成出寶霍苷Ⅰ和寶藿苷Ⅱ。Zhang 等[41]通過培養(yǎng)甘草和白桑的細胞懸浮液，以淫羊藿苷為底物進行生物轉(zhuǎn)化研究，通過光譜分析確定結(jié)構(gòu)，生物合成出兩種新的代謝物icaruralins A、icaruralinsB（手性異構(gòu)體），以及已知的代謝產(chǎn)物寶藿苷Ⅰ（圖3），表明白桑和甘草的細胞懸浮液可選擇性地水解淫羊藿黃酮苷類化合物C7 位上的葡萄糖基。

4 其他

研究表明，鹽酸和硫酸可脫去淫羊藿苷和淫羊藿總黃酮母核上的糖基，且水解率較高，但反應(yīng)不易控制，易產(chǎn)生淫羊藿苷元等產(chǎn)物[42-43]。此外，劉接卿等[44]和牟關(guān)敏等[45]分別以三羥基苯乙酮和間苯三酚為原料，經(jīng)過12步反應(yīng)或9 步反應(yīng)實現(xiàn)了淫羊藿苷元的合成，但合成路線均較為煩瑣且收率較低。孟坤等[46]以山柰酚-4-氧甲醚為原料，經(jīng)過4 步反應(yīng)合成出純度超過98%的淫羊藿苷元，收率為30%。總的來說，酸水解法多通過水解黃酮苷類化合物C3 位和C7 位的糖基來制備淫羊藿苷元;而合成法則是以組成其母核結(jié)構(gòu)的化合物為原料，通過逐步合成來實現(xiàn)淫羊藿苷元的制備。

5 結(jié)語

隨著淫羊藿低糖苷類化合物藥理作用研究的不斷深入和新藥研發(fā)的不斷進展，其市場需求將會越來越大[47]。目前，淫羊藿低糖苷類化合物的制備多以酶水解法和微生物轉(zhuǎn)化法為主，兩者均是通過相關(guān)酶來脫去多糖苷類化合物上的糖基，從而轉(zhuǎn)化生成低糖苷類化合物。

酶水解法具有反應(yīng)條件溫和、專一性強、污染少等優(yōu)點，是淫羊藿低糖苷類化合物制備的重要途徑，被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)改造和修飾領(lǐng)域[48-49]。該法常用的酶包括蝸牛酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶，可通過特異性脫去母核C7、C3 位上的葡萄糖基或鼠李糖基來生成新的糖苷類化合物。由于蝸牛酶和纖維素酶的關(guān)鍵組分均為β-葡萄糖苷酶，而后者的主要作用位點為淫羊藿黃酮苷類化合物C7 位上的β-葡萄糖基，故其水解產(chǎn)物主要為含有鼠李糖基的淫羊藿次級苷和寶藿苷等;α-L-鼠李糖苷酶的主要作用位點為淫羊藿黃酮苷類化合物C3 位上的鼠李糖基，故其水解產(chǎn)物多為含有葡萄糖苷的淫羊藿苷等。

淫羊藿黃酮苷類化合物的生物轉(zhuǎn)化主要通過切除黃酮苷類化合物上的糖基來獲得低糖苷類化合物，從而為相關(guān)原料藥的生產(chǎn)提供支持。酶水解法中，α-L-鼠李糖苷酶的水解工藝仍處于實驗室研究階段;微生物轉(zhuǎn)化法和植物細胞轉(zhuǎn)化法制備淫羊藿低糖苷類化合物轉(zhuǎn)化體系的穩(wěn)定性和產(chǎn)物的高效轉(zhuǎn)化與分離是工業(yè)化應(yīng)用的前提，相關(guān)工藝尚缺乏工業(yè)化放大生產(chǎn)的可行性研究;酸水解法和合成法制備中存在副產(chǎn)物多、收率低和環(huán)境污染等問題，且產(chǎn)物主要以淫羊藿苷元為主。因此，后續(xù)研究應(yīng)圍繞酶水解法和微生物轉(zhuǎn)化法等的放大生產(chǎn)工藝展開，進一步解決和完善工業(yè)化生產(chǎn)過程中所伴隨的問題，從而實現(xiàn)科研成果真正產(chǎn)業(yè)化。