壽 婕，董建淼，潘月燕

（1.浙江省紹興生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，浙江 紹興 312000；2.浙江中諾檢測(cè)技術(shù)有限公司，浙江 紹興 312000；3.浙江大工檢測(cè)研究有限公司，浙江 紹興 312000）

微囊藻毒素是常見(jiàn)的藍(lán)藻毒素，是由藍(lán)藻水華等爆發(fā)所產(chǎn)生的一種單環(huán)七肽物質(zhì)，具有多器官毒性、遺傳毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性和潛在的促癌性，并能引起受試生物發(fā)育異常，微囊藻毒素對(duì)水體環(huán)境和人體健康的危害已成為全球關(guān)注的重大環(huán)境問(wèn)題之一。微囊藻毒素具有水溶性和耐熱性，加熱煮沸都不能將毒素破壞，自來(lái)水處理工藝的混凝沉淀、過(guò)濾、加氯、氧化、活性炭吸附等也不能將其完全去除。微囊藻毒素易溶于水、甲醇或丙酮，不揮發(fā)，抗pH變化，其化學(xué)性質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定，自然降解過(guò)程十分緩慢。微囊藻毒素在去離子水中可保持穩(wěn)定狀態(tài)長(zhǎng)達(dá)27天，在滅菌的河水中可保持穩(wěn)定12天，而在普通河水中可穩(wěn)定7天。

隨著濃縮、富集、分離方法和儀器技術(shù)的進(jìn)步，定量分析微囊藻毒素的方法也在不斷進(jìn)步，且應(yīng)用越來(lái)越廣泛。液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS）以液相色譜為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測(cè)系統(tǒng)。微囊藻毒素樣品在質(zhì)譜部分和流動(dòng)相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開(kāi)，經(jīng)檢測(cè)器得到質(zhì)譜圖[1]。所以只要知道相對(duì)分子質(zhì)量，就可以對(duì)樣品進(jìn)行精確的定量檢測(cè)?！兜乇硭h(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB3838-2002）中規(guī)定了微囊藻毒素LR的標(biāo)準(zhǔn)限值為1 μg/L，本文采用固相萃取對(duì)水樣進(jìn)行富集，超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定量分析，檢出限能夠滿(mǎn)足地表水標(biāo)準(zhǔn)限值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（Waters premier，Waters公司）；全自動(dòng)固相萃取儀；HLB固相萃取柱；Caliper樣品自動(dòng)濃縮儀。

甲醇（美國(guó)Fisher試劑公司色譜純?cè)噭?；甲酸（美?guó)Fisher公司色譜純）；微囊藻毒素LR的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)批號(hào)是ALX-350-043 L29994，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量為100 μg；微囊藻毒素RR的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)批號(hào)是ALX-350-012 L29995，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量為100 μg。

1.2 水樣預(yù)處理?xiàng)l件及步驟

1.2.1 柱活化及條件化

先用15 mL甲醇活化柱子，再用15 mL水移去活化試劑。柱活化及條件化流速為5.0 mL/min。

1.2.2 上樣

設(shè)定上樣體積為505 mL（水樣500 mL+5 mL甲醇，設(shè)定多的體積是為了保證上樣瓶里的水樣能夠完全進(jìn)樣），以5.0 mL/min的流速使水樣全部通過(guò)HLB柱，上樣結(jié)束后用15 mL 5%甲醇水以5.0 mL/min沖洗柱子，去除水溶性干擾物。吹氮?dú)?5分鐘使HLB柱徹底干燥。

1.2.3 洗脫

用10 mL甲醇洗脫HLB柱，收集洗脫液，洗脫劑流速為1.0 mL/min。

1.2.4 濃縮

用甲醇沖洗收集管，將洗脫液合并后，在Caliper樣品自動(dòng)濃縮儀上濃縮到0.5 mL，再加入1.5 mL 50%甲醇水進(jìn)行溶劑置換，最后定容至1.0 mL，供超高效液相色譜——三重四級(jí)桿質(zhì)譜測(cè)定。

1.3 超高效液相色譜和質(zhì)譜條件

液相色譜條件：色譜柱，ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm 2.1×50 mm）；柱溫40 ℃；流動(dòng)相采用甲醇和0.1%甲酸水溶液[2]；等度洗脫；流速0.40 mL/min；進(jìn)樣量10 uL。

質(zhì)譜條件：電噴霧正離子模式（ESI+）；質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方式定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取小柱

選擇了C18柱、活性炭小柱、HLB小柱進(jìn)行分析，結(jié)果表明只有HLB小柱能滿(mǎn)足需要，其他2種柱子的回收率都比較低。因此確定用HLB柱來(lái)富集水中的微囊藻毒素。

2.2 液相條件的優(yōu)化

色譜柱的選擇：比較了兩種色譜柱，分別是C18色譜柱[3]（1.7 μm 2.1×50 mm），T3色譜柱（1.8 μm 2.1×50 mm）。實(shí)驗(yàn)表明，C18色譜柱對(duì)微囊藻毒素有較好的柱效，因此選擇了C18色譜柱。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

用1 mL甲醇分別溶解LR和RR標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粉末，配成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液槍分別移取100 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液到10 mL容量瓶，用純甲醇定容至刻度線，配成1 000 μg/L的LR和RR標(biāo)準(zhǔn)混合使用液。

用移液槍移取標(biāo)準(zhǔn)混合使用液50 μL、80 μL、100 μL、150 μL、200 μL至waters進(jìn)樣瓶，用50%甲醇水定容到1.0 mL，制作低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表1。

表1 微囊藻毒素-LR和微囊藻毒素-RR標(biāo)準(zhǔn)曲線及測(cè)定結(jié)果

用移液槍移取標(biāo)準(zhǔn)混合使用液200 μL、250 μL、300 μL、400 μL、500 μL、600 μL至waters進(jìn)樣瓶，用50%甲醇水定容到1.0 mL，制作高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表2。

表2 微囊藻毒素-LR和微囊藻毒素-RR標(biāo)準(zhǔn)曲線及測(cè)定結(jié)果

2.4 方法檢出限

在測(cè)定檢出限時(shí)，最少測(cè)定七個(gè)重復(fù)的低濃度加標(biāo)樣品，加標(biāo)的濃度要適宜，一般為預(yù)期值的3～5倍，再根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)偏差，以3.143倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差作為方法檢出限。

本方法分別用七個(gè)0.10 μg/L的500 mL模擬水溶液進(jìn)行平行試驗(yàn)，結(jié)果如表3。微囊藻毒素-LR的檢出限為0.017 μg/L，微囊藻毒素-RR的檢出限為0.060 μg/L。

表3 微囊藻毒素-LR和RR方法檢出限結(jié)果

2.5 精密度與回收率實(shí)驗(yàn)

2.5.1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

配制濃度為0.16 μg/L和0.9 μg/L的微囊藻毒素LR和RR模擬水溶液，進(jìn)行精密度試驗(yàn)，結(jié)果如表4。結(jié)果表明，高、低濃度的微囊藻毒素模擬水溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，能夠滿(mǎn)足地表水水質(zhì)分析的需要。

表4 微囊藻毒素-LR和RR的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（μg/L）

2.5.2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取純水樣品，加入不同體積的微囊藻毒標(biāo)準(zhǔn)溶液，形成高、低濃度的加標(biāo)樣品，按實(shí)驗(yàn)步驟分別進(jìn)行6次測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明，微囊藻毒素-LR的加標(biāo)回收率范圍為70.5%～76.1%，微囊藻毒素-RR的加標(biāo)回收率范圍為72.8%～87.5%。

表5 微囊藻毒素-LR和RR加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

利用HLB小柱對(duì)水樣中的微囊藻毒素進(jìn)行富集凈化，用甲醇和甲酸為流動(dòng)相，通過(guò)優(yōu)化前處理及檢測(cè)條件，用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)地表水中微囊藻毒素，該方法避免衍生等繁瑣步驟，方法靈敏度高，能夠滿(mǎn)足實(shí)際工作需求。在50-600 μg/L范圍內(nèi)，有很好的線性相關(guān)性，微囊藻毒素LR方法的檢出限為0.017 μg/L，能夠滿(mǎn)足我國(guó)地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中微囊藻毒素LR的濃度限值檢測(cè)要求。