田洪昭，尹洪娜，馬育軒，張文釗△

(1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040； 3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

脊髓損傷(SCI)是多種原因引起脊髓結(jié)構(gòu)、功能的損害，導(dǎo)致感覺、運動或自主神經(jīng)功能障礙的疾病，其影響著患者的身體、心理和社交能力[1]。SCI后由于短期內(nèi)需要高水準(zhǔn)的急癥護理和長期治療相關(guān)繼發(fā)性并發(fā)癥，所以需要大量的醫(yī)療保健資源，給患者、家庭及社會帶來了沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[2]。

夾脊電針是中醫(yī)的一種治療方法。其治療脊髓損傷無論是在臨床，還是在基礎(chǔ)實驗中都具有良好的效果，影響機制眾多[3-6]。

而自噬(Autophagy)機制被認(rèn)為是脊髓損傷的治療靶點之一。自噬(Autophagy)是一個降解細胞蛋白和細胞器的細胞內(nèi)的系統(tǒng)，自噬可分為三大類:大自噬、小自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(Chaperone-mediated autophagy,CMA)。在這3種途徑中，以形成獨特的雙膜細胞器自噬體為特征的大自噬(以下簡稱自噬)研究最為廣泛，自噬是一種保守的細胞生存途徑，它分解受損的蛋白質(zhì)和細胞器以維持體內(nèi)平衡，是一種潛在的營養(yǎng)來源。細胞的胞質(zhì)內(nèi)容物被自噬體隔離，最終傳遞到溶酶體進行降解[7]。自噬可以用兩種不同的方法來監(jiān)測[8]：①直接觀察自噬相關(guān)結(jié)構(gòu);②蛋白質(zhì)和細胞器的自噬/溶酶體依賴降解的定量。對自噬結(jié)構(gòu)在一定時間點的靜態(tài)分析常常導(dǎo)致不準(zhǔn)確的解釋。為了準(zhǔn)確估計自噬活性，必須確定自噬流，即自噬降解量。本研究旨在研究夾脊電針對自噬流的影響，明確其治療脊髓損傷的機制。

1 實驗方法

1.1 實驗動物

48只清潔級Sprague Dawley雌性大鼠，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，10周齡左右，體質(zhì)量220～250 g，安置于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)針灸臨床神經(jīng)生物學(xué)重點實驗室動物房，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，保持室內(nèi)溫度和濕度相對恒定，12 h光照/黑暗循環(huán)，大鼠自由進食飲水，動物使用和護理規(guī)程符合國家衛(wèi)生研究院制定的《實驗動物使用和護理指南》。

1.2 實驗材料及儀器

蘇木素染色液(北京Biotopped)；LC3B Rabbit PolyClonal antibody、p62 Rabbit PolyClonal antibody(美國proteintech)；PV-6001兔二步法試劑盒(兔聚合物法檢測系統(tǒng))(北京中杉金橋)；beta-Actin Mouse MonoClonal antibody、HRP-Goat-Anti-Rabbit IgG(H+L)、HRP-Goat-Anti-Mouse IgG(H+L)(美國proteintech)；二磷酸氯喹(美國 Sigma)；Impactor M-Ⅲ型脊髓打擊器(美國)、Micro Plus型脈沖電針儀(美國)；封閉用山羊血清(北京中杉金橋)、RM2235石蠟切片機(德國Leica)、miniPRO4迷你垂直電泳儀(北京WIX)、濕式轉(zhuǎn)印儀(北京WIX)；Micro Plus型脈沖電針儀(BioMedical Life Systems,Inc,Vista,CA,USA)。

1.3 模型建立

應(yīng)用NYU Impactor M-Ⅲ打擊器制作Allen’s模型，大鼠在術(shù)前10 h禁食，用10 %水合氯醛(3.0 mL/kg)，腹腔注射，麻醉SD大鼠，并置于俯臥位，固定四肢。觸碰背部棘突圓鈍點，為椎體T10，消毒后沿脊柱方向做一個約5 cm的背中部縱向切口。剝離椎旁肌并壓迫止血，暴露椎體T9～11，小心夾碎椎板并去除，暴露完好硬脊膜。用NYU Impactor M-Ⅲ打擊器進行撞擊，參數(shù)如下:一根重10 g(底部直徑2.5 mm)的沖擊棒，落差為50 mm，損傷能量為50 g·cm，造成相對嚴(yán)重?fù)p傷[9-10]。

造模成功的標(biāo)志：當(dāng)打擊棒接觸到脊髓時，與探針形成回路后發(fā)出警笛聲，此時軟件提示無錯誤，電腦描記撞擊過程呈拋物線樣曲線。同時大鼠有搖尾反射或(和)雙下肢及軀體回縮撲動，立即移除沖擊棒，觀察到脊髓組織紅腫、充血，標(biāo)志撞擊成功。打擊完成后，在切口部位局部敷以抗生素(阿莫西林)[11]?？p合后將大鼠置于單籠，采用燈照保暖措施，每天早晚各1次輔助排尿，直至排尿反射恢復(fù)。

1.4 實驗分組及干預(yù)

1.4.1 假手術(shù)組(Sham) 只行椎板摘除，不進行打擊損傷。

1.4.2 模型組(Model) 椎板摘除后進行打擊損傷。

1.4.3 電針組(EA) 椎板摘除后進行打擊損傷。損傷后6 h進行夾脊電針治療。操作方法：選取T10上、下棘突間隙旁開7 mm以內(nèi)處取穴。常規(guī)消毒后，用毫針向脊柱方向刺入，使針尖觸及椎板。采用電針儀正極連接上端針柄，負(fù)極連接同側(cè)下端針柄。選取參數(shù)：①脈沖波形：連續(xù)脈沖波形；②脈沖重復(fù)頻率：100 Hz；③電流輸出強度：以背部肌肉出現(xiàn)輕微抽動為度(約1 mA)。持續(xù)30 min，1日1次。

1.4.4 電針+抑制劑組(EA+CQ) 椎板摘除后進行打擊損傷，損傷后6 h進行夾脊電針治療，同時腹腔注射抑制劑CQ (C6628)，注射劑量為50 mg/kg/d，直至處死大鼠。

以上4組每日同時捆綁操作。

Sham組、Model組和EA組每日注射與CQ相同劑量的生理鹽水。

1.5 指標(biāo)檢測

采用Basso-Beattie-Bresnahan (BBB)評分量表[12]對脊髓損傷大鼠的后肢功能恢復(fù)進行評價。分?jǐn)?shù)越高，運動功能越好。各組大鼠按照SCI后3 d、7 d進行動態(tài)評估，將大鼠放于開放視野場地自由移動5 min，由兩名研究人員采用盲法進行評分，取平均值進行計算。

評分后給大鼠注射過量的10 %的水合氯醛腹腔注射，等待完全麻醉后，將大鼠俯臥位放置，快速斷頭處死，將脊髓組織在冰袋上快速取出并放入4 %多聚甲醛中和液氮中備用。采用免疫組化和WB法檢測大鼠脊髓組織LC3、P62的表達。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 實驗結(jié)果

2.1 BBB評分結(jié)果

Sham組3 d和7 d兩個時間點評分均為21分，表示沒有運動障礙。Model組術(shù)后各個時間點評分顯著低于Sham組(P<0.01)，說明有明顯的運動障礙。EA組在3 d和7 d時間點評分均高于Model組，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。而注射抑制劑CQ后EA+CQ組在3d和7d評分均低于EA組，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明CQ可以部分消除夾脊電針的治療作用。見表1。

表1 各組大鼠BBB評分結(jié)果

2.2 IHC檢測結(jié)果

2.2.1 IHC檢測大鼠脊髓組織LC3的平均光密度值 LC3棕黃色陽性標(biāo)記主要表達于神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的胞漿中，術(shù)后3 d和7 d時間點，Model組LC3平均光密度值顯著高于Sham組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，EA組治療后LC3平均光密度值升高，在3 d和7 d時間點與Model組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，而注射抑制劑CQ后EA+CQ組各個時間點平均光密度值均高于EA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 各組大鼠LC3平均光密度值 (IOD/Area)

結(jié)果說明脊髓損傷后LC3的表達量升高，這可能與溶酶體功能缺陷導(dǎo)致自噬體降解減弱有關(guān)。而夾脊電針有促進LC3表達的作用，增加自噬體的形成。而在夾脊電針治療的基礎(chǔ)上注射溶酶體抑制劑CQ可加劇LC3表達，導(dǎo)致自噬體的過量堆積。

2.2.2 IHC檢測大鼠脊髓組織P62的平均光密度值 P62棕黃色陽性標(biāo)記主要表達于神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的胞漿中，在術(shù)后3 d和7 d時間點，Model組P62的平均光密度值明顯高于Sham組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。EA組治療后在3 d和7 d時間點P62平均光密度值均低于Model組，差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而注射抑制劑CQ后EA+CQ組平均光密度值升高，在3d和7d時間點，與EA組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3、圖2。

表3 各組大鼠P62平均光密度值 (IOD/Area)

說明脊髓損傷后自噬降解底物P62的表達量升高，夾脊電針有降低P62表達的作用，促進自噬體降解并加快自噬流。而在夾脊電針治療的基礎(chǔ)上注射抑制劑CQ可加劇P62表達，堵塞了自噬流。

Westernblot檢測各組大鼠脊髓組織LC3-Ⅱ蛋白表達情況 術(shù)后3 d和7 d時間點，Model組LC3-Ⅱ蛋白表達量相對于Sham組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。而經(jīng)過EA組治療后，繼續(xù)升高LC3-Ⅱ蛋白的表達量，在3 d和7 d時間點，與Model組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。而注射抑制劑CQ后EA+CQ組LC3-Ⅱ蛋白繼續(xù)升高，在3 d和7 d時間點，與EA組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 見圖3、表4。

表4 各組大鼠LC3-Ⅱ相對蛋白表達情況(LC3-Ⅱ/β-actin)

以上結(jié)果說明脊髓損后LC3-Ⅱ蛋白表達升高，自噬體增多，可能因自噬流堵塞導(dǎo)致，而夾脊電針治療后繼續(xù)升高LC3-Ⅱ蛋白表達量，可能與促進自噬體的生成有關(guān)。在夾脊電針的基礎(chǔ)上注射抑制劑CQ，導(dǎo)致LC3-Ⅱ蛋白表達量繼續(xù)升高，自噬體大量堆積。

3 討論

近年來，越來越多的研究關(guān)注自噬在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的作用，自噬作為一種重要而保守的溶酶體降解途徑，被認(rèn)為參與了許多生理與病理過程，并通過對受損蛋白和細胞器的處理和能量再利用或生產(chǎn)，在維持細胞內(nèi)平衡方面發(fā)揮著重要作用，前期課題組證明夾脊電針促進自噬而抑制神經(jīng)細胞凋亡，從而促進大鼠后肢功能的恢復(fù)。另一方面，一些研究人員在報告中提出，抑制自噬可以發(fā)揮神經(jīng)保護作用[13-14]。而自噬在SCI中的作用似乎存在爭議。該爭議與自噬流有關(guān)，自噬流是一個動態(tài)過程，包括自噬體的形成、傳遞和降解。單獨自噬體的增多并不能證明自噬的增強，可能由于自噬體降解的減少或隨著自噬體形成增加而不能降解，發(fā)生自噬體的積累，從而抑制了自噬流。自噬的有益或有害功能可能取決于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后自噬流的誘導(dǎo)或抑制，通暢的自噬流通常導(dǎo)致細胞保護，而受阻的自噬流導(dǎo)致細胞死亡。因此，調(diào)節(jié)自噬流可能有利于SCI的治療。LC3是目前使用最廣泛的自噬體標(biāo)記物，因為LC3-Ⅱ的表達水平反映了自噬體和自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)的數(shù)量。p62/SQSTM1也被認(rèn)為是自噬流的標(biāo)志物，P62是一種銜接蛋白，可將泛素化的底物導(dǎo)向自噬體。由于P62隨著自噬與其底物一起降解，當(dāng)自噬流加快時，P62蛋白水平降低。相反，自噬流的減少導(dǎo)致P62蛋白積累，p62的水平代表自噬體的降解速率。

而溶酶體功能在促進自噬流方面起到重要作用。而抑制溶酶體功能后，即晚期自噬，導(dǎo)致自噬體不能被順利降解而堆積，LC3和P62的含量增高。自噬體可以作為組裝壞死復(fù)合物的支架[15-20]，進一步介導(dǎo)細胞破裂死亡，屬于“自噬性細胞死亡”的范疇。晚期抑制劑巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1)對溶酶體降解的抑制作用導(dǎo)致LC3-Ⅱ和p62的積累，晚期抑制劑還有E64d和胃蛋白酶抑制劑[21]，體內(nèi)實驗使用溶酶體抑制劑氯喹(Chloroquine,CQ)較多[22-26]。

夾脊電針是針刺效應(yīng)和電場作用的雙重結(jié)合。針刺治療時采用局部選穴，在損傷節(jié)段上下取夾脊穴，夾脊穴與督脈和膀胱經(jīng)并行，督脈是陽脈之海，總督一身之陽氣，督脈受阻，陽氣不達四末。而膀胱經(jīng)與督脈毗鄰，所以脊髓損傷也會造成膀胱經(jīng)受阻，經(jīng)氣不能從頭走足，再次加重下肢陽氣供應(yīng)的缺乏。而夾脊穴針刺可以通行兩經(jīng)脈道，扶督脈之陽氣，助膀胱經(jīng)經(jīng)氣，促進兩經(jīng)經(jīng)脈暢通。吳永剛等[27]研究認(rèn)為損傷2～8 h針刺治療脊髓損傷可明顯促進脊髓血流量的增加，所以早期針刺對大鼠脊髓損傷有治療作用。外加電場在細胞實驗中已經(jīng)證明可以加速細胞遷移，調(diào)節(jié)細胞增殖，指導(dǎo)細胞分裂的方向，影響細胞的形狀和方向，在脊髓損傷中外加電場可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞分化和血管生成，促進神經(jīng)生長和神經(jīng)元遷移，加速軸突在神經(jīng)修復(fù)部位的萌發(fā)，上調(diào)運動神經(jīng)元中的神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達等，所以電刺激在臨床上已被廣泛用于改善脊髓和神經(jīng)肌肉損傷后的功能預(yù)后[3]。

本實驗應(yīng)用BBB量表進行評分并記錄。最初，行為功能，特別是運動功能都是通過修改Tarlov和Klinger開發(fā)的評分量表來評估的[28]。Basso、Beattie和Bresnahan[9]開發(fā)了一種有效的、擴展的和明確的評定量表(BBB量表)來對各個實驗室的運動結(jié)果測量進行標(biāo)準(zhǔn)化，BBB量表是通過使用俄亥俄州立大學(xué)(OSU)或紐約大學(xué)(NYU)設(shè)計并制造的可控電磁打擊裝置，可造成較多數(shù)量大鼠脊髓損傷，并對脊髓損傷大鼠康復(fù)模式進行評估而制定的。實驗研究此量表可以區(qū)分應(yīng)用NYU裝置在不同高度打擊大鼠T10部位造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷結(jié)果的差異。并且行為學(xué)結(jié)果得分與組織學(xué)損傷高度相關(guān)。根據(jù)觀察到的運動恢復(fù)模式，確定胸椎SCI評分類別，并對其進行定義和排序。BBB量表為研究人員提供了一種有效的鑒別和預(yù)測運動恢復(fù)的方法，因此也能夠評估脊髓損傷后功能的治療。結(jié)果顯示治療3 d和7 d時，夾脊電針BBB評分優(yōu)于模型組，說明夾脊電針可以治療脊髓損傷并改善大鼠行為學(xué)評分。而給予抑制劑CQ后消除了部分夾脊電針的治療作用。

應(yīng)用IHC法和Western blot法檢測到LC3和P62主要表達于神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的胞漿中，術(shù)后3 d和7 d時間點，LC3、LC3-Ⅱ和P62平均光密度值明顯高于Sham組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，證明自噬流的堵塞，可能因為溶酶體在打擊后失去融合和降解自噬體功能所致。EA組治療后LC3、LC3-Ⅱ平均光密度值在各個時間點均高于Model組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而P62平均光密度值均低于Model組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明電針治療后可促進LC3、LC3-Ⅱ的升高、降低P62的表達，加快了自噬流。其治療機制可能與增加自噬體的生成和改善溶酶體功能有關(guān)。而注射抑制劑CQ后EA+CQ組3 d和7 d時間點LC3、LC3-Ⅱ和P62平均光密度值升高，與EA組比較各個時間點，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明CQ有部分消除夾脊電針促進自噬流的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果揭示了夾脊電針通過恢復(fù)神經(jīng)元通暢的自噬流，最終改善SD大鼠急性脊髓損傷后肢運動功能的新機制。因此，這些結(jié)果有助于更深入地了解夾脊電針的神經(jīng)保護作用。