劉士力 ,李飛 ,賈永義 ,鄭建波 ,遲美麗 ,程順 ,卞玉玲,顧志敏

（1.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室/浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點實驗室，浙江 湖州 313001；2.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306）

鲌亞科中體型最大的翹嘴鲌（Culter alburnus Basilewsky）（俗稱白魚）肉質(zhì)潔白、細嫩而不腥，是我國重要的淡水名優(yōu)經(jīng)濟魚類之一。翹嘴鲌是以活魚為餌料的兇猛肉食性魚類，能起到維持淡水水域生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的作用，具有良好的生態(tài)價值。自20世紀90 年代人工繁殖獲得成功后，其養(yǎng)殖技術(shù)、飼料開發(fā)、產(chǎn)品加工等均得到快速發(fā)展[1]，已經(jīng)成為了穩(wěn)定的養(yǎng)殖魚類。開展翹嘴鲌的育種具有重要的經(jīng)濟意義，浙江省淡水水產(chǎn)研究所已開展了翹嘴鲌的群體選育、雜交育種、雌核發(fā)育及偽雄魚誘導(dǎo)工作，培育了2 個水產(chǎn)新品種。

最早在1976 年，Tsushima 等就在兔的肝細胞膜上發(fā)現(xiàn)了生長激素受體（Growth hormone receptor,ghr）基因[2]。生長激素（Growth hormone，GH）必須通過與靶組織細胞表面的GHR 結(jié)合而啟動細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)機制，發(fā)揮其生理功能。目前在哺乳動物中僅發(fā)現(xiàn)一種編碼GHR 的基因[3]，但在很多魚類基因組中卻發(fā)現(xiàn)了另外一種基因編碼的生長激素受體GHR2[4-6]。鑒于GHR 的重要功能，其DNA 序列的多態(tài)性可能與生長性狀相關(guān)。倪靜等[7]分析了兩個群體牙鲆（Paralichthys olivaceu）ghr基因5′ 端啟動子區(qū)的微衛(wèi)星，發(fā)現(xiàn)均與生長具有一定的相關(guān)性。目前已開發(fā)了一些翹嘴鲌的微衛(wèi)星標記[8,9]，開展了翹嘴鲌GH-IGFs 軸相關(guān)基因及微衛(wèi)星的研究[10-12]。劉士力等[13]以翹嘴鲌轉(zhuǎn)錄組中獲得的mRNA 為基礎(chǔ)，獲得了ghr1 和ghr2 的部分基因序列。經(jīng)過初步研究，發(fā)現(xiàn)其中4 個多態(tài)性微衛(wèi)星位點與生長性狀具有一定相關(guān)性。ghr1 中內(nèi)含子1、2序列較長，當(dāng)時沒有對其內(nèi)含子1、2 中微衛(wèi)星進行實驗。本試驗進一步研究其中8 個微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性，分析了微衛(wèi)星基因型和翹嘴鲌的體長、體質(zhì)量的相關(guān)性，可為翹嘴鲌ghr1 基因微衛(wèi)星特征研究及分子標記輔助育種提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用翹嘴鲌雌魚40 尾、雄魚68 尾采自浙江省淡水水產(chǎn)研究所八里店綜合實驗基地，人工催產(chǎn)后放入產(chǎn)卵池產(chǎn)卵，收集受精卵孵化后養(yǎng)殖在同一條件下。12 月齡時剪取少量尾鰭，用無水乙醇浸泡于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用于翹嘴鲌DNA 提取的試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR 反應(yīng)試劑購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取

采用苯酚-氯仿法提取樣本DNA。用1%瓊脂糖凝膠檢測提取DNA 完整性。DNA 原液于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank 公布的翹嘴鲌ghr1 基因及其側(cè)翼DNA 序列（登錄號:KX925976），在內(nèi)含子1 中有3 個微衛(wèi)星位點，內(nèi)含子2 中有5 個微衛(wèi)星位點。應(yīng)用Primer Premier 6.0 軟件分別設(shè)計8 對引物用于微衛(wèi)星位點的擴增，上游引物的5′ 端加上Tail A 堿基序列，通用引物Tail A 5′端用FAM進行修飾。具體引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

表1 翹嘴鲌ghr1 基因內(nèi)含子1、2 中微衛(wèi)星引物序列Tab.1 Primer sequences used for microsatellite amplification in the intron 1 and 2 of the ghr1 gene in topmouth culter C.alburnus

1.2.3 微衛(wèi)星擴增及分型

微衛(wèi)星擴增的PCR 反應(yīng)體系和程序參照本實驗室之前的操作[12]。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行微衛(wèi)星分型。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用POPGENE 1.3.1 計算微衛(wèi)星座位在該群體內(nèi)的觀測等位基因數(shù)（Observed number of alleles,Na）、觀察雜合度（Observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度（Expected heterozygosity，He）、有效等位基因數(shù)（effective number of alleles,Ne）和多態(tài)信息含量（Polymorphism information content,PIC）。運用SPSS 13.0 的一般線性模型（General Linear Model,GLM）程序分析微衛(wèi)星位點與翹嘴鲌體質(zhì)量和體長的關(guān)系。顯著性分析由單因素方差分析（ANOVA）方差分析的Duncan 氏法進行多重比較，P＜0.05 為差異顯著。結(jié)果以平均值±標準誤（Mean±SE）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 翹嘴鲌ghr1 基因內(nèi)含子1、2 中微衛(wèi)星位點檢測結(jié)果

瓊脂糖電泳結(jié)果表明：所設(shè)計引物擴增的產(chǎn)物條帶清晰，無雜帶，長度符合預(yù)期。將這8 個微衛(wèi)星位點在24 個樣本中進行多態(tài)性檢測，結(jié)果表明除了ghr1-2 中（CA）6微衛(wèi)星位點外，ghr1 中的另外7個位點均具有多態(tài)性。將這7 個微衛(wèi)星位點在120尾同批繁殖、同塘養(yǎng)殖的翹嘴鲌中進行分析。

位于第1 內(nèi)含子中的位點ghr1-1 和ghr1-3 分別具有16 和9 個等位基因，ghr1-1 中的優(yōu)勢等位基因為451 bp、453 bp 和455 bp，3 個總頻率占54.7%。ghr1-3 中的優(yōu)勢等位基因261 bp 頻率為43.0%，微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)為9 次。重復(fù)次數(shù)為7、8、9、10 次的基因型占全部基因型的93.9%。

位于第2 內(nèi)含子中的位點ghr1-4 具有非常高的多態(tài)性。檢測到34 個等位基因，具有76 種基因型。由于基因型較多，沒有頻率超過5%的基因型。在ghr1-5 和ghr1-6 均觀察到3 個位點，其中g(shù)hr1-5 檢測到3 個等位基因，分別為277 bp、279 bp和281 bp，對應(yīng)的微衛(wèi)星核心重復(fù)次數(shù)分別是3、4和5 次，其中等位基因281 bp 的頻率最高，達到了96.2%；ghr1-6 檢測到3 個等位基因，分別為375 bp、377 bp 和379 bp，對應(yīng)的微衛(wèi)星核心重復(fù)次數(shù)分別是7、8 和9 次，其中等位基因377 bp 的頻率最高，達到了91.2%。ghr1-7 為本次研究唯一的四堿基重復(fù)微衛(wèi)星，檢測到17 個等位基因，具有62 種基因型。ghr1-8 有7 個等位基因，其中等位基因456 bp 頻率為49.2%，占有絕對優(yōu)勢。

2.2 翹嘴鲌ghr1 基因內(nèi)含子1、2 中微衛(wèi)星位點的遺傳多態(tài)性參數(shù)

遺傳特性分析結(jié)果表明，翹嘴鲌ghr1 基因內(nèi)含子1 和2 中的這7 對引物觀測等位基因數(shù)（Na）為3～34（平均12.714），期望雜合度（He）為0.074～0.929（平均0.625），香農(nóng)指數(shù)（I）為0.1882～2.9185（平均1.617），多態(tài)信息含量（PIC）為0.073～0.898（平均0.608），有效等位基因數(shù)（Ne）為0.074～0.898（平均5.839），其中g(shù)hr1-4、ghr1-7 的Ne 均大于10，具有良好的多態(tài)性。ghr1-5 和ghr1-6 的Ne 小于2，PIC小于0.25，屬低度多態(tài)位點。其余5 個微衛(wèi)星位點PIC 均大于0.5，屬于高度多態(tài)位點。

2.3 翹嘴鲌ghr1 基因內(nèi)含子1、2 中微衛(wèi)星位點與體長和體質(zhì)量的關(guān)聯(lián)分析

表2 翹嘴鲌ghr1 基因內(nèi)含子1、2 中微衛(wèi)星位點的等位基因頻率Tab.2 The allele frequency of two microsatellite loci in the intron 1 and 2 of gene in topmouth culter C.alburnus ghr1

除去基因型個體數(shù)目小于5%的數(shù)據(jù)后進行單因素方差分析。ghr1-4 位點由于有76 種基因型，但各基因型的個體數(shù)目不夠，因此被排除在分析之外。ghr1-5 位點281/281 型占92.5%，另外兩種基因型較少，也被排除在分析之外。因此共有5 個位點參與關(guān)聯(lián)分析。

微衛(wèi)星位點ghr1-3 對于體長的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明：257/259 型個體占樣本數(shù)的7.5%，其體長最長，也是體質(zhì)量最高的個體；259/261、259/263 和261/263 型的體長較短，顯著低于257/259 型個體。對于體質(zhì)量的分析結(jié)果表明，257/259 型個體除了顯著高于這3 種基因型外，還高于257/261 和261/261 型（P＜0.05）。其余位點不同基因型個體體長和體質(zhì)量均有差異，但差異均不顯著（P＞0.05）。

3 討論

微衛(wèi)星DNA（Microsatellite DNA）是真核生物基因組重復(fù)序列中的重要組成部分，穩(wěn)定性好、可重復(fù)性強、檢測技術(shù)高效簡便,但篩選多態(tài)性微衛(wèi)星是一個相對繁瑣的過程。以前常用的方法有磁珠富集法、跨物種擴增和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選等。但這些方法都有其局限性，如磁珠富集法和所采用的探針有很大的關(guān)系。目前采用較多的是CA 和GATA 探針，這兩種探針的微衛(wèi)星在基因組中含量更高一些，但忽略了探針以外其他微衛(wèi)星的研究。跨物種擴增由于進化和變異的關(guān)系，擴增的產(chǎn)物不一定包含微衛(wèi)星，擴增產(chǎn)物長度的變化可能不是微衛(wèi)星造成，這會給實驗結(jié)果帶來誤差。轉(zhuǎn)錄組中獲得的微衛(wèi)星往往多態(tài)性不高，限制了其應(yīng)用范圍。功能基因中的微衛(wèi)星更有可能與生長性狀相關(guān)，但某些內(nèi)含子較長，不易擴增。通過基因組直接篩選是最為準確的方法，近年來高通量測序技術(shù)不斷完善，測序的通量增大，讀長增加，成本大幅下降。本實驗通過翹嘴鲌基因組序列分析獲得了ghr1 的內(nèi)含子1，2 的序列，研究了其中的微衛(wèi)星多態(tài)性。

表3 7 個微衛(wèi)星位點在120 尾翹嘴鲌中的多態(tài)性信息Tab.3 Polymorphism information for 7 microsatellite loci in 120 individuals of topmouth culter C.alburnus

表4 翹嘴鲌ghr1 基因內(nèi)含子1、2 中微衛(wèi)星位點不同基因型與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析Tab.4 Association analysis between growth traits and different genotypes of microsatellite locus in the intron 1 and 2 of ghr1 gene in topmouth culter C.alburnus

本試驗檢測了翹嘴鲌群體中g(shù)hr1 基因內(nèi)含子1、2 中的8 個微衛(wèi)星位點，表明7 個具有多態(tài)性。ghr1-6 和ghr1-7 屬于低度多態(tài)性位點（PIC＜0.25），另外5 個屬于高度多態(tài)性位點（PIC＞0.5）。ghr1-4 和ghr1-7 有效等位基因數(shù)高于10，在個體識別中具有良好的應(yīng)用前景。ghr1-7 為四堿基重復(fù)微衛(wèi)星（GATA）12，在120 個樣品中檢測到17 個等位基因，具有62 種基因型，多態(tài)信息含量為0.898，具有良好的多態(tài)性。其余為二堿基重復(fù)微衛(wèi)星，5 個為CA重復(fù)類型，1 個為GA 重復(fù)類型，1 個為CA 和GA的復(fù)合型。在這7 個二堿基重復(fù)微衛(wèi)星位點中，ghr1-2 不具有多態(tài)性，ghr1-5 和ghr1-6 雖然分別具有3 個等位基因，但其中優(yōu)勢等位基因均在90%以上，有效等位基因數(shù)低于1.2，PIC 小于0.25，屬于低度多態(tài)性位點。對這些微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)的觀察，發(fā)現(xiàn)ghr1-5 位點分別為277 bp、279 bp 和281 bp，對應(yīng)的微衛(wèi)星核心重復(fù)次數(shù)分別是3、4 和5 次。其中等位基因281 bp 的頻率最高，達到了96.2%；ghr1-6 檢測到3 個等位基因，分別為375 bp、377 bp和379 bp，對應(yīng)的微衛(wèi)星核心重復(fù)次數(shù)分別是7、8和9 次，重復(fù)次數(shù)均為連續(xù)。ghr1-4 為復(fù)合型微衛(wèi)星，檢測到34 個等位基因，具有非常高的多態(tài)性，沒有觀察到明顯的規(guī)律。其他微衛(wèi)星位點中占10%以上的位點區(qū)域都是連續(xù)的。如ghr1-8 中，456 占49.2%，其相鄰的454 和458 均為11.3%，3 者合計占71.8%。推測這些微衛(wèi)星核心重復(fù)次數(shù)在變異過程中傾向于1 次增加或減少了1 個重復(fù)。

研究人員經(jīng)常在ghr1 基因中獲得一些和生長性狀關(guān)聯(lián)的分子標記。陶文靜等[14]對5 尾鯉（Cyprinus carpio）的4 個ghr 基因進行檢測，共找到38 處SNPs 位點，采用PCR-RFLP 方法大規(guī)模檢測了其中5 個SNP 位點，發(fā)現(xiàn)均與增重顯著相關(guān)。半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）ghr1 外顯子8 和9 中各存在1 個SNP 位點。在外顯子8 的SNP 位點中不同基因型的樣本的在ghr1 的表達和生長性狀均有顯著區(qū)別[15]。除了SNP 位點外，ghr1 基因序列中的SSR 也有可能與生長性狀關(guān)聯(lián)。倪靜等在牙鲆ghr基因5′端啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)一個多態(tài)性微衛(wèi)星位點，在2 個養(yǎng)殖群體的不同基因型樣本之間生長性狀均有顯著差異[7]。本團隊已初步研究了翹嘴鲌ghr1 中的微衛(wèi)星，外顯子2 和內(nèi)含子8 中分別包含（CT）6和（AC）5的微衛(wèi)星序列。但這2 個微衛(wèi)星位點在所研究的群體中均沒有多態(tài)性。內(nèi)含子1，2 相對較長，當(dāng)時沒有對其中的微衛(wèi)星進行研究。在獲得翹嘴鲌基因組序列后，對其中包含微衛(wèi)星的研究變得簡便。通過120 尾同批繁殖、同塘養(yǎng)殖的翹嘴鲌中進行實驗。微衛(wèi)星位點的關(guān)聯(lián)分析表明，ghr1-3 位點中高于或等于5%的基因型有8 個。257/259 型個體占樣本數(shù)的7.5%，其體長和體質(zhì)量均高于其他基因型，其體質(zhì)量與245/261 和259/259 差異不顯著，但顯著高于另外5 種基因型（P＜0.05）。接下來將在不同地理種群或者近緣物種做進一步研究。本研究結(jié)果從分子水平上為翹嘴鲌的保種、選育和高效育種提供了理論依據(jù)。