靳曉東，王霞，張曉靜，周建

（1.河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003；2.長垣市林業(yè)局）

據(jù)《全國土壤污染狀況調(diào)查報告》[1]顯示，全國土壤總超標率達到16.1%，而鉛、鎘污染分別達到7.0%、1.5%。其中，農(nóng)田土壤的重金屬污染尤為嚴重[2]，對環(huán)境和人類健康形成了極大的危害。土壤中重金屬可在農(nóng)產(chǎn)品富集，然后通過食物鏈進入人體，給人體帶來嚴重的健康問題，如腎功能衰竭、骨頭痛、神經(jīng)疼痛等[3]。因此，對土壤重金屬污染的治理勢在必行。

目前，重金屬土壤污染修復(fù)可分為物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)、生物修復(fù)等。物理修復(fù)法見效快，但耗費人力，易破壞土壤結(jié)構(gòu)[4]；化學(xué)修復(fù)效果明顯，但成本較高，修復(fù)范圍受限[5]；生物修復(fù)分為植物修復(fù)與微生物修復(fù)，其植物修復(fù)屬原位修復(fù)，成本低廉，對環(huán)境友好，安全系數(shù)高[6]，近年得到廣泛應(yīng)用。湯葉濤等[7]發(fā)現(xiàn)，圓錐南芥對Pb/Cd/Zn 復(fù)合污染土壤具有很大的潛力修復(fù)。蜈蚣草是鎘超富集植物，對鎘污染修復(fù)極具生態(tài)價值；鳳尾蕨對銅的富集效果最好，在銅污染修復(fù)中發(fā)揮積極作用[8]。在礦區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，類蘆對鉛有較強的富集，能在礦區(qū)正常生長[9]。

螯合劑能選擇性地螯合多種金屬離子[10]，大致分為人工合成螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA），與天然螯合劑[11]，如檸檬酸、胡敏酸。目前，EDTA 在重金屬污染土壤修復(fù)中應(yīng)用最廣[12-13]。但是，EDTA 生物降解困難，易產(chǎn)生二次污染[14]。相比EDTA，天然螯合劑易降解，生態(tài)安全[15]，可提高植物對污染土壤的修復(fù)效率。CA 能顯著活化土壤銅離子，促進煙草對銅的富集[15]。與此類似，檸檬酸可有效提高吊蘭對銅的吸收與轉(zhuǎn)運，使其地上部分的銅含量達到190.188 μg·g-1，明顯提升污染土壤的修復(fù)效果[16]。在重金屬污染稻田中，低濃度腐殖酸可促進水稻對鎘的富集，但高濃度腐殖酸則顯著降低了水稻中鎘含量[17]。

刺槐（Robinia pseudoacacia）是豆科落葉喬木，生長速度快，根分蘗能力強，具有較強的多維抗逆性，如抗旱能力較強，在中性、酸性和含鹽量低于0.3%土壤中能正常生長，具有很強的生態(tài)效應(yīng)[18]。刺槐在鐵尾礦廢棄地的種植適應(yīng)性最強[19]，可作為適宜鐵尾礦修復(fù)的最佳樹種。同時，刺槐的鉛脅迫耐受能力強[20]。王國娟[21]通過室內(nèi)盆栽發(fā)現(xiàn)，鉛離子主要富集在刺槐莖部、根部。因此，作為一種較好的生態(tài)樹種，刺槐可廣泛應(yīng)用于非生物逆境的植物修復(fù)。

試驗以刺槐為對象，在鉛鎘污染土壤中添加CA、HA，通過測定刺槐根系與其土壤特征，探索兩者對于刺槐修復(fù)鉛鎘污染土壤的調(diào)控效應(yīng)，為進一步強化刺槐在鉛鎘污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

刺槐、檸檬酸、胡敏酸。

1.2 試驗設(shè)計

將園土、腐葉土、基質(zhì)按2∶2∶1 的體積比配制土壤，土壤容重為0.82 g·cm-1，總孔隙度為66.67%，電導(dǎo)率鹽濃度為211.00 mg·L-1，有機質(zhì)含量為2.02%。隨后，加入硝酸鉛和氯化鎘，鉛、鎘離子濃度設(shè)置為600、20 mg·kg-1。最后在污染土壤中加入CA 和HA，濃度梯度均設(shè)置為0.5、5.0、10.0 mmol·kg-1，分別命名 為CA0.5、CA5.0、CA10.0、HA0.5、HA5.0、HA10.0，其質(zhì)量百分數(shù)為0.009 6%、0.096 0%、0.192 0%、0.015 4%、0.154 0%、0.308 0%。同時，以僅加硝酸鉛和氯化鎘，不加螯合劑的土壤作為對照。

選取飽滿的刺槐種子，溫水浸泡24 h；隨后將種子均勻放置于濕紗布上，然后再覆蓋一層濕紗布，置于向陽處催芽48 h；待1/3 種子露白時播種，采用育苗盤播種。每個處理一個育苗盤，共6 個育苗孔（長、寬、高分別為5、5、5.5 cm），分3 行，每行2 個育苗孔為一個重復(fù)，共計3 次重復(fù)。每孔播種3 粒種子，覆土0.5～1 cm。最后在育苗盤的托盤中加水，使土壤充分濕潤。等幼苗發(fā)育40 d 時取樣，測定相關(guān)指標。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤取樣

在取土過程中，要清除殘留的須根及表面雜質(zhì)，保留根系范圍內(nèi)約1/3 的心土。將心土內(nèi)須根和雜質(zhì)去除后，置于烘箱中80 ℃烘10 h，直至恒重。將干土在研缽中搗碎，然后過篩（2 mm）。最后土樣放入密封袋，密封保存。

1.3.2 植物根系生長指標

用Epson Expression 11000XL 根系掃描儀掃描根系。先洗凈根系泥土，切忌傷根；隨后于根莖處剪下根系，再用蒸餾水漂洗；將根系平放于根盤，加蒸餾水直至根系浸沒；用小鑷子將根系分開，呈分散狀；蓋好背景板，掃描根系。最后，用WinRHIZO Pro 2007 軟件對根系圖片進行指標分析。重復(fù)3 次。

1.3.3 植物根系活力

用TTC 染色法測定根系活力[22]。取0.5 g 左右的根尖，置入0.4%TTC 與66 mmol·L-1磷酸緩沖液（pH7.0）的等量混合液中，根尖完全浸沒；樣品置于恒溫箱37 ℃暗反應(yīng)3 h；取出燒杯，加入2 mL 1 mol·L-1的硫酸終止反應(yīng)；取出根尖，濾紙吸水后移入研缽中，加入少許石英砂與5 mL 乙酸乙酯研磨；將研磨液移入離心管，取5 mL 乙酸乙酯少量多次清洗研缽，將殘渣移入離心管；4 300 rpm 離心5 min，取上清液。最后，485 nm 處測定上清液OD 值。重復(fù)3 次。根據(jù)標準曲線計算TTC 還原量。

根系活力的計算公式：

TTC 還原強度（mg/g*h）=TTC 質(zhì)量×1000/根系質(zhì)量×?xí)r間

1.3.4 土壤pH 值

稱取2.5 g 土樣，置入10 mL 蒸餾水中；玻棒攪拌1 min，直至均勻；靜置30 min 后，用濾紙過濾殘渣；將電極插入土樣濾液中，待其穩(wěn)定后記錄pH 值。重復(fù)3 次。

1.3.5 土壤酸性磷酸酶

采用試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）測定土壤酸性磷酸酶（S-ACP）活性。

（1）粗酶液提取

稱取0.1 g 土樣，放于離心管，加入50 μL 甲苯，輕搖混勻，常溫靜置15 min；加入0.4 mL 試劑一，輕搖混勻后置于恒溫箱37 ℃催化24 h；完成后迅速向離心管加入1 mL 試劑二，停止酶促反應(yīng)；將離心管置入離心機，25 ℃下6 000 rpm 離心10 min，最后取上層清液待用。

（2）酶活性測定

取容積1 mL 的玻璃比色皿，依次加入10 μL 蒸餾水、20 μL 試劑三、4 μL 試劑四，充分混合均勻；顯色后再加入166 μL 蒸餾水，輕搖混勻，室溫靜置30 min；在660 nm 處測定吸光度，記為空白管。隨后，將10 μL 蒸餾水換成10 μL 標準液，相同操作，標記為標準管；換成10 μL 上清液，標記為測定管。重復(fù)3 次測定。

（3）酶活性計算

按照如下公式計算酶活性：

C-標準液體積；V 總-催化體系總體積；W-土壤樣品質(zhì)量；T-催化反應(yīng)時間

1.3.6 土壤鉛鎘含量測定

稱取0.1 g 土樣放入聚四氟乙烯燒杯，按10∶5∶3體積比依次加入硝酸、氫氟酸、高氯酸，玻棒攪勻。將燒杯置于電熱板上180 ℃消解3 h；然后輕搖燒杯，待樣品溶解后，開蓋趕酸；待溶液趕酸至黃豆粒大小時，用0.2%稀硝酸轉(zhuǎn)移消解液，定容至10 mL。最后，用原子吸光光度法測定鉛含量，用ICP-MS 法測定鎘含量。重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Microsoft excel 2010 處理數(shù)據(jù)，作圖；用IBM SPSS Statistics 21.0 行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CA、HA 對鉛鎘脅迫下刺槐根系生長指標的影響

如圖1-a 所示，在鉛鎘脅迫下，檸檬酸與胡敏酸對刺槐總根表面積的影響相似。添加0.5、5.0、10.0 mmol·kg-1CA 后，總根表面積分別低于對照16.40%、21.19%、11.53%，差異不顯著（P＞0.05）。5.0 mmol·kg-1HA 處理顯著降低了根系的總根表面積，低于對照值60.31%（P<0.05）；0.5、10.0 mmol·kg-1HA 處理的總根表面積低于對照8.97%、25.43%，但差異不顯著（P＞0.05）。

在試驗中，添加CA 和HA 后，刺槐根系的總根體積呈下降趨勢（圖1-b）。添加0.5、5.0、10.0 mmol·kg-1CA 后，總根體積分別低于對照23.31%、37.43%、15.96%（P＞0.05）。在5.0 mmol·kg-1HA 處理中，根系總根體積顯著低于對照70.06%（P<0.05）；添加0.5、10.0 mmol·kg-1HA 后，脅迫植株的總根體積分別下降了16.48%、37.37%，但差異不顯著（P＞0.05）。

與前兩者相似，檸檬酸與胡敏酸降低了刺槐根系平均直徑（圖1-c）。在0.5、5.0、10.0 mmol·kg-1CA處理中，根系平均直徑分別低于對照5.13%、16.14%、2.49%，差異不顯著（p＞0.05）。添加0.5、10.0 mmol·kg-1HA 后，刺槐的平均根系直徑下降，但與對照值差異不顯著（p＞0.05）；在5.0 mmol·kg-1HA 處理中，刺槐平均根系直徑顯著低于對照21.51%（P<0.05）。

在鉛鎘脅迫下，CA 抑制刺槐根尖的發(fā)育，而HA 基本促進根尖發(fā)育（圖1-d）。添加0.5、5.0、10.0 mmo·lkg-1CA 后，刺槐根尖數(shù)分別低于對照24.72%、4.55%、17.61%（P＞0.05）。在0.5、10.0 mmol·kg-1HA 處理中，刺槐的根尖數(shù)分別提高23.01%、64.20%，其中高濃度處理差異顯著（P<0.05）；添加5.0 mmol·kg-1HA 后，刺槐根尖數(shù)低于對照34.94%（P＞0.05）。

在試驗中，在CA 和HA 的調(diào)控下，鉛鎘脅迫植株的總根長呈下降趨勢，但均差異不顯著（P＞0.05）（圖1-e）。添加0.5、5.0、10.0 mmol·kg-1檸檬酸后，刺槐的總根長分別下降10.76%、9.45%、8.55%；在0.5、5.0、10.0 mmol·kg-1HA 處理中，脅迫植株的總根長分別低于對照2.84%、48.49%、12.72%。

與總根長表現(xiàn)相似，CA 和HA 基本抑制脅迫植株的根系分枝數(shù)，但均差異不顯著（P＞0.05）（圖1-f）。在0.5、5.0、10.0 mmol·kg-1檸檬酸處理中，刺槐根系分枝數(shù)分別下降20.11%、32.07%、12.85%。添加0.5 mmol·kg-1HA 后，刺槐根系的分枝數(shù)高于對照15.20%；而5.0、10.0 mmol·kg-1HA 處理植株的根系分支數(shù)量分別下降60.23%、25.59%。

圖1 CA 與HA 處理下刺槐鉛鎘脅迫植株的根系發(fā)育Fig.1 Root development of Pb-Cd-stressed seedlings for R.pseudoacacia under CA and HA treatments

2.2 CA、HA 對鉛鎘脅迫下刺槐根系活力的影響

在試驗中，隨著檸檬酸濃度的增加，刺槐根系活力呈下降趨勢，具體見圖2。添加0.5 mmol·kg-1CA 后，根系活力高于對照13.43%；在5.0、10.0 mmol·kg-1CA處理中，刺槐根系活力分別下降5.77%、31.53%，但差異均不顯著（P＞0.05）。與前者相反，隨著HA 濃度增加，刺槐根系活力逐步上升。添加0.5 mmol·kg-1HA 后，根系活力低于對照23.74%（P＞0.05）；在5.0、10.0 mmol·kg-1HA 處理中，刺槐的根系活力分別上升50.97%、80.94%，其中高濃度處理差異顯著（P<0.05）。

圖2 CA 與HA 處理下刺槐鉛鎘脅迫植株的根系活力Fig.2 Root activities of Pb-Cd-stressed seedlings for R.pseudoacacia under CA and HA treatments

2.3 CA、HA 對鉛鎘脅迫下刺槐土壤pH 值的影響

從圖3 可看出，在鉛鎘脅迫下，檸檬酸與胡敏酸降低了土壤pH 值，由堿性變成了微酸性。添加0.5、5.0、10.0 mmol·kg-1CA 后，土壤pH 值分別降低20.77%、20.95%、20.02%；而在0.5、5.0、10.0 mmol·kg-1HA 處理中，土壤pH 值分別降低20.55%、19.36%、20.15%，均與對照差異顯著（P<0.05）。

圖3 CA 與HA 處理下鉛鎘污染土壤的pH 值Fig.3 pH values of Pb-Cd-polluted soil under CA and HA treatments

2.4 CA、HA 對鉛鎘脅迫下刺槐土壤酸性磷酸酶活性的影響

在鉛鎘脅迫下，檸檬酸與胡敏酸對土壤酸性磷酸酶活性的影響存在差異（圖4）。隨著檸檬酸處理濃度增加，污染土壤的酸性磷酸酶活性先降后升，其中5.0 mmol·kg-1CA 處理的土壤酸性磷酸酶活性最低，低于對照28.93%；10.0 mmol·kg-1CA 處理的酶活性則達到峰值，高于對照57.23%，均差異不顯著（P＞0.05）。與前者相反，HA 調(diào)控的酸性磷酸酶活性先升后降，在5.0 mmol·kg-1處理中，酶活性達到峰值，高于對照值84.91%；10.0 mmol·kg-1處理的土壤酶活性降到最低，低于對照63.52%（P＞0.05）。

圖4 CA 與HA 處理下鉛鎘污染土壤的酸性磷酸酶活性Fig.4 Soil acid phosphatase activities of Pb-Cd-polluted soil under CA and HA treatments

2.5 CA、HA 對鉛鎘脅迫下刺槐土壤中鉛鎘含量的影響

從圖5-a 中可以看出，在鉛鎘脅迫下，CA 與HA 對土壤鉛含量的影響存在差異。添加0.5、5.0 mmol·kg-1CA后，刺槐修復(fù)的土壤的鉛含量分別高于對照8.96%、5.77%（P＞0.05）；10.0 mmol·kg-1CA 處理降低了土壤鉛含量，顯著低于對照值14.45%（P<0.05）。添加0.5、5.0、10.0 mmol·kg-1HA 后，刺槐修復(fù)的土壤的鉛含量明顯降低，顯著低于對照18.50%、21.40%、30.94%（P<0.05）。

圖5 天然螯合劑處理下鉛鎘污染土壤的離子濃度Fig.5 Soil ion concentrations of Pb-Cd-polluted soil under CA and HA treatments

與對鉛的調(diào)控相反，檸檬酸與胡敏酸增加了土壤的鎘含量（圖5-b）。添加0.5、5.0、10.0 mmol·kg-1CA 后，土壤鎘含量分別高于對照261.65%、185.28%、128.28%，均差異顯著（P<0.05）。在0.5、5.0、10.0 mmol·kg-1HA 處理中，刺槐修復(fù)的土壤的鎘含量顯著上升，顯著高于對照157.50%、196.13%、184.19%（P<0.05）。

3 討論

試驗發(fā)現(xiàn)，高濃度檸檬酸處理與所有胡敏酸處理的土壤鉛離子含量顯著低于對照，而兩種螯合劑處理土壤的鎘離子含量顯著高于對照。表明高濃度CA、HA 提高了刺槐對鉛污染的修復(fù)效率，促進刺槐對鉛離子的富集；而CA 與HA 調(diào)控刺槐修復(fù)土壤鎘污染的效果不明顯，可能抑制了刺槐對鎘的吸收。外源胡敏酸促進刺槐對土壤鉛的修復(fù)，降低土壤鉛濃度，這與茶樹[23]的表現(xiàn)相似。這種促進現(xiàn)象應(yīng)該是增加了植物組織中纖維素結(jié)合態(tài)鉛的比例，促進鉛通過根系維管向上轉(zhuǎn)運[23]，成為富集重金屬離子的重要途徑[24]。同時，隨著CA、HA 濃度的增加，對土壤中碳酸鎘的活化增強，使得生物可利用有效態(tài)Cd2+的含量降低[25]，進而降低了植株對鎘的富集。通過水培試驗，薛衛(wèi)杰[26]發(fā)現(xiàn)外源檸檬酸明顯鈍化鎘的轉(zhuǎn)運，降低了水稻幼苗對鎘的富集。類似的，添加胡敏酸后，黑麥草對Cd2+的轉(zhuǎn)運與富集能力受到明顯抑制[27]。

鉛鎘污染土壤中添加HA 與CA 后，刺槐根系的發(fā)育低于正常水平，應(yīng)該是鉛離子在刺槐體內(nèi)富集，從而對細胞形成生理毒害，影響了植株根系的發(fā)育[28]。其次，土壤鎘含量較高，會對根系形成直接的生物毒害，造成H2O2在植物細胞中積累，導(dǎo)致非酶系統(tǒng)和抗氧化酶系統(tǒng)紊亂[29]，進而影響根系發(fā)育。但在HA 與CA 的調(diào)控下，刺槐根系發(fā)育與正常水平差異不顯著，也表明二者對植物所受的重金屬毒害具有一定緩解作用[27]。

在試驗中，胡敏酸與檸檬酸在一定的濃度范圍降低土壤pH 值，與小飛揚草表現(xiàn)相似[30]。土壤由堿性變成微酸性，從而提高土壤中各種營養(yǎng)成分和元素的有效性，改善了土壤質(zhì)量，可在一定程度上緩解根系發(fā)育的抑制[31]。同時，CA 和HA 對刺槐根系活力產(chǎn)生影響，但絕大部分差異不顯著，而中高濃度HA顯著提高了根系活力。表明這兩種螯合劑，尤其是胡敏酸具有降低植物體內(nèi)鉛離子毒害的功能，通過增加根系細胞壁的果膠總糖和糖醛酸的含量，增強細胞壁吸附、鈍化鉛離子活性[23]，維護細胞功能，保持根系活力。

4 結(jié)論

根據(jù)前期試驗數(shù)據(jù)得出如下結(jié)論：

（1）在鉛鎘脅迫下，胡敏酸與檸檬酸調(diào)控刺槐根系生長發(fā)育穩(wěn)定。

（2）中高濃度胡敏酸顯著促進刺槐鉛鎘脅迫植株的根系活力，可以作為刺槐修復(fù)鉛鎘污染土壤的外源輔助措施。

（3）HA 與CA 將鉛鎘污染土壤由堿性變?yōu)槲⑺嵝?，改善了土壤質(zhì)量。

（4）高濃度檸檬酸與胡敏酸能提高刺槐對鉛污染土壤修復(fù)效率，其中10.0 mmol·kg-1胡敏酸處理的調(diào)控效果最佳；兩者對鎘污染土壤修復(fù)的調(diào)控效果均不明顯。

在試驗中，10.0 mmol·kg-1HA 對鉛鎘脅迫下刺槐根系與土壤特性的綜合調(diào)控效果最優(yōu)，可以作為外源措施參與刺槐對鉛污染土壤的修復(fù)。但試驗對HA 的臨界值設(shè)置還不夠精準。因此，在后期要通過進一步試驗，精準找出胡敏酸調(diào)控刺槐修復(fù)鉛污染土壤的臨界值，以便于胡敏酸在鉛污染土壤修復(fù)中發(fā)揮更好的調(diào)控效果，進一步提高修復(fù)效率。