趙強(qiáng)，陳素玉，王廣達(dá)，杜艷麗，杜吉到，2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319；2.黑龍江省鹽堿地改良工程技術(shù)研究中心）

鹽堿脅迫是自然界中廣泛存在的一種非生物脅迫，嚴(yán)重影響作物的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的形成。世界范圍內(nèi)大約4.15×108hm2的土地呈現(xiàn)漬化，已經(jīng)成為制約全球作物布局和生產(chǎn)的主要因素[1]。我國(guó)鹽堿化的耕地面積約為760 萬(wàn)hm2，占全國(guó)可利用土地總面積的4.88%[2]。黑龍江省土壤鹽堿化問(wèn)題嚴(yán)重，全省鹽堿化土壤面積已超過(guò)200 萬(wàn)hm2，鹽堿化耕地面積超過(guò)30 萬(wàn)hm2，且近年來(lái)有逐年增加的趨勢(shì)[3]。自然界中的鹽堿土通常包含中性鹽和堿性鹽，導(dǎo)致土壤溶液呈現(xiàn)高鹽度和高酸堿度（PH 值≥8）的特點(diǎn)，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[4]。鹽堿脅迫導(dǎo)致的滲透脅迫會(huì)影響植物的形態(tài)特征和生理進(jìn)程，例如影響相對(duì)生長(zhǎng)率、水分供給、蒸騰速率、水分利用效率、養(yǎng)分吸收能力、氣孔導(dǎo)度、光合作用效率、產(chǎn)量構(gòu)成因素及產(chǎn)量的形成[5-6]。而在長(zhǎng)期的鹽堿脅迫下，植物體內(nèi)Na+和Cl-的大量累積會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生離子毒害作用，導(dǎo)致細(xì)胞代謝和生理進(jìn)程的紊亂[4]。鹽堿脅迫對(duì)植物最直觀(guān)的影響表現(xiàn)為抑制種子萌發(fā)[7-8]、抑制光合作用[9]、阻礙植株生長(zhǎng)等[10]，這些影響在植物生長(zhǎng)的不同時(shí)期表現(xiàn)有所差異[11]，不同植物種類(lèi)也會(huì)對(duì)鹽堿脅迫表現(xiàn)出不同的敏感性[12-13]。因此，明確鹽堿脅迫對(duì)植物的生長(zhǎng)影響，培育耐鹽堿品種，研發(fā)提高植物耐鹽堿能力的調(diào)控措施，對(duì)提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力意義重大。

通常來(lái)講，鹽堿等非生物脅迫對(duì)植物的最直觀(guān)的影響是改變植株的形態(tài)特征。由于植物的形態(tài)特征同時(shí)受到基因型和環(huán)境因素的影響，因此，植物形態(tài)特征的改變可以直觀(guān)地反映出不同植株對(duì)脅迫的反應(yīng)和耐受性差異。在生理指標(biāo)檢測(cè)和分子標(biāo)記等技術(shù)被廣泛應(yīng)用之前，人們就開(kāi)始根據(jù)植物的形態(tài)特征對(duì)作物的品種進(jìn)行定向的選擇、培育和改良工作。通常情況下，植物可測(cè)量的形態(tài)指標(biāo)包括株高、莖粗、葉片形態(tài)（包括葉片面積、數(shù)量、葉面傾角、結(jié)構(gòu)、分布等）、植株形態(tài)（包括倒伏、分蘗、形態(tài)、抗病蟲(chóng)害、抗旱等）、根形態(tài)（包括根系體積、表面積、長(zhǎng)度、直徑、根尖數(shù)量等）、果實(shí)特征（包括果實(shí)大小、形狀、數(shù)量、顏色等）等。然而，由于植物形態(tài)特征指標(biāo)的種類(lèi)復(fù)雜性、受環(huán)境影響的多變性、生育周期全程動(dòng)態(tài)性和統(tǒng)計(jì)分析的復(fù)雜性，導(dǎo)致植物的形態(tài)學(xué)研究滯后于基因型研究。

近年來(lái)，隨著光學(xué)成像傳感器技術(shù)的發(fā)展，自動(dòng)化植物表型測(cè)試和分析技術(shù)被廣泛的應(yīng)用于植物形態(tài)指標(biāo)檢測(cè)，從而誕生了“前景光明（aspiring）”的表型組學(xué)[14]。植物表型分析技術(shù)能夠在不破壞植物生長(zhǎng)狀態(tài)的情況下，高通量、高效率、高精度、低誤差的收集植物的表型數(shù)據(jù)，并通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的綜合定量分析，形成不同條件下的植物表型組數(shù)據(jù)，并可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)植物的形態(tài)和生理性狀指標(biāo)的變化[15]。通過(guò)將表型組與基因組、代謝組、生理指標(biāo)等數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，定量的反映出植物生長(zhǎng)、產(chǎn)量和適應(yīng)性等生物學(xué)信息與環(huán)境變化和非生物脅迫等自然因素之間的復(fù)雜相關(guān)性，為分析逆境脅迫對(duì)植物的影響、建立植物生長(zhǎng)模型和作物新品種的選育提供參考依據(jù)[16-17]。大豆是我國(guó)重要的糧油兼用作物，是人類(lèi)主要的植物性蛋白和油脂的主要來(lái)源，對(duì)鹽堿脅迫非常敏感。關(guān)于鹽堿脅迫對(duì)大豆種子萌發(fā)、植株形態(tài)、葉片光合及產(chǎn)量性狀的影響研究已有相關(guān)報(bào)道[18-21]，但少有結(jié)合形態(tài)指標(biāo)和光譜數(shù)據(jù)定量分析鹽堿脅迫對(duì)大豆生長(zhǎng)影響的研究。

研究利用植物表型分析系統(tǒng)Planteye F500，對(duì)鹽堿脅迫下不同品種的大豆幼苗植株進(jìn)行多光譜三維掃描，同步測(cè)定植株的形態(tài)指標(biāo)和光譜特征參數(shù)，定量分析鹽堿脅迫對(duì)大豆幼苗植株的生長(zhǎng)影響，為表型組學(xué)在大豆抗鹽堿栽培措施改良和耐鹽堿大豆品種選育等研究上的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料的培養(yǎng)

大豆品種黑河49（HH49，鹽堿不敏感大豆品種）和合農(nóng)95（HN95，鹽堿敏感大豆品種）的種子由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院豆類(lèi)作物抗逆高產(chǎn)技術(shù)創(chuàng)新栽培團(tuán)隊(duì)提供。試驗(yàn)于2021 年7 月15 日，在國(guó)家雜糧工程技術(shù)中心（黑龍江省，大慶市，E125°17＇，N45°59＇）盆栽場(chǎng)地內(nèi)進(jìn)行。挑選大小均一、飽滿(mǎn)、無(wú)病斑、無(wú)蟲(chóng)斑的大豆種子，分別播種于盛有正常土（CK，PH=7.4）和鹽堿土（SA，混有25 mM NaCl、25 mM NaSO4、12.5 mM Na2CO3和12.5 mM NaHCO3，PH=9.5）的塑料盆中（上口徑18 cm，下口徑12.5 cm，高15 cm），每盆播入大豆種子6 粒。待大豆植株真葉展開(kāi)后，挑選長(zhǎng)勢(shì)均勻一致的大豆幼苗進(jìn)行定苗，每盆保留大豆幼苗2 棵。在大豆植株的第三葉期（V3）進(jìn)行表型測(cè)定，每個(gè)處理重復(fù)5 次。

1.2 大豆幼苗形態(tài)指標(biāo)掃描測(cè)定

使用植物激光三維表型儀Planteye F500（Phenospex，瑞士）對(duì)大豆植株幼苗進(jìn)行掃描，以測(cè)量和收集植物的表型數(shù)據(jù)。PlantEye F500 掃描儀可收集植物在藍(lán)光波段（RBlue，峰值波長(zhǎng)460～485 nm）、綠光波段（RGreen，峰值波長(zhǎng)530～540 nm）、紅光波段（RRed，峰值波長(zhǎng)620～645 nm）、近紅外波段（RNIR，峰值波長(zhǎng)820～850 nm）和3D 激光（940 nm）的光譜反射率。儀器的參數(shù)設(shè)置如下：Z 軸長(zhǎng)（掃描儀底部向下測(cè)量的距離）= 70 cm，分辨率<0.1 mm；Y 軸分辨率（Vscan=50 mm·s-1）=1 mm；X 軸分辨率=0.19 mm。利用Phena 軟件（Phenospex，荷蘭）建立植物的三維模型，并使用HortControl 軟件（Phenospex，荷蘭）計(jì)算植物相關(guān)形態(tài)指標(biāo)。測(cè)量?jī)?nèi)容包括植株的數(shù)字生物量、數(shù)字株高、葉片角度、葉片投影面積、葉片傾斜度和光穿透度。

1.3 大豆幼苗植株光譜參數(shù)測(cè)定

利用植物激光三維表型儀測(cè)定植株的色調(diào)值（hue），建立植株的3D 模型，并根據(jù)不同波長(zhǎng)的光譜反射率數(shù)據(jù)計(jì)算植株的光譜參數(shù)，計(jì)算公式如下：

綠 度 指 數(shù)（Greenness index，GI）=（2 ×RGreen-RRed-RBlue）/（RGreen+RRed+RBlue）；

歸一化植被指數(shù)（Normalized difference vegetation index，NDVI）=（RNIR-RRed）/（RNIR+RRed）。

1.4 大豆幼苗生物量的測(cè)定

從大豆幼苗植株的子葉節(jié)位置將地上部分剪下，使用直尺測(cè)量其實(shí)際株高；使用游標(biāo)卡尺測(cè)量其莖粗；使用萬(wàn)分之一天平測(cè)量地上部分鮮重。使用自來(lái)水洗凈植株根系上附著的泥土，并用吸水紙吸干根系表面的水分，測(cè)量其鮮重。將植株地上部分和根系樣品分別裝入牛皮紙信封中，置于105 ℃烘箱內(nèi)烘干30 min 后，于80 ℃烘干至恒重，測(cè)量其干重。

1.5 數(shù)據(jù)分析與作圖

利用SPSS Statistics 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理。使用SigmaPlot 12.5 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽堿脅迫對(duì)大豆幼苗植株生長(zhǎng)的影響

圖1 表示的是使用正常土和鹽堿土種植大豆時(shí)幼苗植株的生長(zhǎng)狀態(tài)。從圖1 中可以看出，與對(duì)照組相比較，鹽堿脅迫能夠抑制黑河49（HH49，鹽堿不敏感大豆品種）和合農(nóng)95（HN95，鹽堿敏感大豆品種）植株的生長(zhǎng)。對(duì)大豆品種HH49 和HH59 的植株進(jìn)行生物量測(cè)定，結(jié)果如表1 所示。與對(duì)照組相比較，鹽堿脅迫顯著（P<0.05）抑制了兩個(gè)大豆品種幼苗株的株高、莖粗、地上干/鮮重和根系的干/鮮重。同時(shí)，鹽堿脅迫下，HN59 植株的各項(xiàng)生物量指標(biāo)的下降幅度均高于HH49。以上結(jié)果表明，HH49 對(duì)鹽堿脅迫的耐受性高于HN59。

圖1 鹽堿脅迫下大豆幼苗植株的生長(zhǎng)狀態(tài)Fig.1 Growth status of soybean seedlings under saline-alkali stress

表1 鹽堿脅迫對(duì)大豆幼苗植株生物量積累的影響Table 1 Effects of saline-alkali stress on biomass accumulation of soybean seedlings

2.2 鹽堿脅迫對(duì)大豆幼苗形態(tài)指標(biāo)的影響

為了定量分析鹽堿脅迫下大豆幼苗植株的形態(tài)變化，采用多光譜掃描儀建立植株的3D 模型，計(jì)算植物的形態(tài)指標(biāo)，結(jié)果如圖2 所示。與對(duì)照相比較，鹽堿脅迫顯著的降低了兩個(gè)大豆品種幼苗植株的數(shù)字生物量、株高、投影葉面積和光穿透度，且對(duì)HN59植株的抑制程度高于對(duì)HH49 植株。鹽堿脅迫對(duì)HH49 植株的葉面積指數(shù)沒(méi)有顯著的影響，但是顯著地降低了HN59 植株的葉面積指數(shù)，降低的幅度達(dá)到17.14 %。雖然鹽堿脅迫對(duì)于HH49 植株的葉片角度沒(méi)有顯著的影響，但是顯著地增加了HN59 植株的葉片角度，增加幅度達(dá)到11.22 %。

圖2 鹽堿脅迫對(duì)大豆幼苗植株形態(tài)指標(biāo)的影響Fig.2 Effects of saline-alkali stress on plant morphological indices of soybean seedlings

2.3 鹽堿脅迫對(duì)大豆幼苗光譜參數(shù)的影響

使用多光譜掃描儀建立的HUE3D模型圖片如圖3 所示，NDVI 模式下大豆的模型圖片如圖4 所示。對(duì)鹽堿脅迫下大豆幼苗的光譜參數(shù)進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖5 所示。與對(duì)照組相比較，鹽堿脅迫顯著的抑制了HH49 和HN59 幼苗植株的色調(diào)值（Hue），降低幅度分別達(dá)到4.89 %和7.69%。同時(shí)，鹽堿脅迫下兩個(gè)大豆品種的歸一化指數(shù)（NVDI）的降低幅度分別達(dá)到8.19%和25.81%，而綠度指數(shù)（GI）的降低幅度分別達(dá)到17.95%和23.23%。

圖3 鹽堿脅迫下大豆幼苗植株的HUE3D 圖像Fig.3 HUE3D images of soybean seedlings under saline-alkali stress

圖4 鹽堿脅迫下大豆幼苗植株的NDVI 圖像Fig.4 NDVIimages of soybean seedlings under saline-alkali stress

圖5 鹽堿脅迫對(duì)大豆幼苗光譜參數(shù)的影響Fig.5 Effects of saline-alkali stress on spectral parameters of soybean seedlings

2.4 各形態(tài)指標(biāo)主成分及相關(guān)性分析

如表2 所示，對(duì)鹽堿脅迫下大豆幼苗植株的15 個(gè)形態(tài)特征指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，以特征值大于1 為閾值，共得到2 個(gè)主成分，對(duì)應(yīng)的特征根分別為3.566 和1.209，其貢獻(xiàn)率分別為84.790%和9.747%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為94.537 %（表2），其余貢獻(xiàn)率較小的成分則忽略不計(jì)。其中，第1 主成分CI1中數(shù)字株高、葉面積指數(shù)、投影葉面積和NDVI 的特征向量最高，分別為0.280、0.280、0.279 和0.27。第2 主成分為中度敏感主成分，其中地上部鮮重的特征向量最高，為0.583。

表2 鹽堿脅迫下大豆幼苗植株各綜合指標(biāo)的系數(shù)及貢獻(xiàn)率Table 2 Coefficient and contribution rate of comprehensive indexes of soybean seedlings under saline-alkali stress

對(duì)鹽堿脅迫下大豆幼苗植株的15 個(gè)形態(tài)特征指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6 所示。鹽堿脅迫下，大豆幼苗植株的葉面積指數(shù)、投影葉面積、莖粗、數(shù)字株高、株高、地上部干重、NDVI 值、光穿透度等指標(biāo)之間呈極顯著正相關(guān)性（P<0.01）；地上部鮮重與地上部干重、數(shù)字生物量等指標(biāo)之間呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性（P<0.05）；數(shù)字生物量與株高、地上部干重和NDVI 值等指標(biāo)之間呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)性（P<0.01），而與葉面積指數(shù)、投影葉面積、莖粗、數(shù)字株高、光穿透度、地上部鮮重等指標(biāo)之間呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性（P<0.05）；GI 指數(shù)與光穿透度呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)性（P<0.01），而與葉面積指數(shù)、投影葉面積、莖粗、數(shù)字株高、NDVI 值、根干重、hue 等指標(biāo)之間呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性（P<0.05）；根干重與光穿透度、NDVI 和GI指數(shù)呈現(xiàn)等指標(biāo)之間呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性（P<0.05）；hue 值與葉面積指數(shù)、投影葉面積、莖粗、數(shù)字株高、株高、NDVI、GI、根鮮重等指標(biāo)之間呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性（P<0.05），而與光穿透度呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)性（P<0.01）；葉片角度與葉面積指數(shù)、投影葉面積、莖粗、數(shù)字株高、株高、地上部干重、NDVI 值、光穿透度和hue 值等指標(biāo)呈極顯著的負(fù)相關(guān)性（P<0.01），而與數(shù)字生物量、GI 和根干重呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)性（P<0.05）。

圖6 鹽堿脅迫下大豆幼苗生物量、形態(tài)和光譜參數(shù)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)分析Fig.6 Correlation coefficient analysis of biomass，morphology and spectral parameters of soybean seedlings under salt-alkali stress

3 討論

鹽堿土壤中較高的鹽離子含量和PH 值能夠引起植物吸水能力下降、體內(nèi)離子失衡、生理代謝紊亂、生長(zhǎng)抑制、質(zhì)量和產(chǎn)量降低，甚至導(dǎo)致植物死亡。因此，培育耐鹽堿的作物品種，提高作物的耐鹽堿能力有利于鹽堿土地的利用，具有較好的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益。相對(duì)于傳統(tǒng)的植物形態(tài)數(shù)據(jù)收集方法，自動(dòng)化表型檢測(cè)技術(shù)能夠綜合的、高通量的、定量的、無(wú)損的、實(shí)時(shí)的分析植物形態(tài)和生理指標(biāo)變化，能夠更加準(zhǔn)確和快速的反應(yīng)出環(huán)境-基因型-表型之間的關(guān)系，有利于優(yōu)良品種的選育和耕作措施的改進(jìn)。

鹽堿脅迫下植株最常見(jiàn)的形態(tài)變化是生物量和葉面積減少，這可能與脅迫條件下植物的蒸騰作用和散熱調(diào)節(jié)等生理代謝進(jìn)程的調(diào)節(jié)反應(yīng)相關(guān)[23]。以前的研究表明，鹽堿脅迫顯著的抑制了野生大豆[24]、大豆[21]、苜蓿[25]、水稻[26]等作物的株高、地上部分和根系的生長(zhǎng)速率和生物量積累，并表現(xiàn)出顯著的基因型差異。在研究中，鹽堿脅迫顯著的降低了兩個(gè)大豆品種的株高、莖粗、地上部的鮮/干重和根系的鮮/干重、數(shù)字生物量、株高、投影葉面積和光穿透度（圖1、2，表1），表明鹽堿脅迫抑制了大豆幼苗植株的生物量積累，并使得株形變得更加的緊湊（圖1）。同時(shí)，鹽堿脅迫下對(duì)HH49 的生物量積累和形態(tài)參數(shù)的抑制程度小于HN59，表明HH49 對(duì)于鹽堿脅迫的耐受性高于HN59，這與我們之前的品種篩選試驗(yàn)的結(jié)果一致。

植物通過(guò)光合作用為機(jī)體提供生長(zhǎng)代謝所需要的能量和物質(zhì)。研究表明，低濃度鹽堿脅迫下，植物葉片的氣孔關(guān)閉，胞間CO2濃度下降，降低了植物的光合速率[27]；而高濃度的鹽堿脅迫引起植株葉片內(nèi)光化學(xué)猝滅和光系統(tǒng)II（PSⅡ）反應(yīng)中心激發(fā)能捕獲效率（F'v/F'm）的下降，從而導(dǎo)致光合速率的降低[28]。在光照條件下，綠色植物的葉片對(duì)紅光波段的光波具有較高的吸收率，而對(duì)近紅外波段具有高的反射率、高的透射率和極低的吸收率[29]。這些光譜參數(shù)可以有效地反映出植株的冠層信息和光合特征，也與植株的生長(zhǎng)狀態(tài)相關(guān)[30]。在研究中，與對(duì)照組相比較，鹽堿脅迫顯著的降低了大豆幼苗植株的hue 值（圖3），表明鹽堿脅迫增加了大豆幼苗植株的紅色、綠色和藍(lán)色的反射率，降低了近紅外反射率，導(dǎo)致光合有效輻射吸收率降低。而歸一化植被指數(shù)（NDVI）和綠度指數(shù)（GI）的降低表明鹽堿脅迫下大豆幼苗植株的光合能力的下降與葉綠素含量降低有關(guān)，這與前人的研究一致[31-33]。GI 和NDVI 通常與葉片內(nèi)葉綠素含量和植物的地上部生物量積累有關(guān)[30，34]。葉綠體作為植物響應(yīng)鹽堿脅迫最重要的細(xì)胞器之一，其內(nèi)葉綠素的含量可作為植物耐鹽堿性的重要參考指標(biāo)之一[28，35]。

在植物的逆境脅迫響應(yīng)研究中，通過(guò)對(duì)脅迫最敏感的植株形態(tài)指標(biāo)或生理指標(biāo)進(jìn)行定量分析，能夠有效地判斷逆境脅迫對(duì)植株生長(zhǎng)的影響，對(duì)于耐性品種的選育具有重要的意義[36]。在研究中，主成分分析和相關(guān)性分析結(jié)果均表明，利用植物表型儀獲得的植物形態(tài)學(xué)指標(biāo)（數(shù)字生物量、數(shù)字株高、葉面積指數(shù)、投影葉面積、NDVI 等）均能夠較好的反應(yīng)出鹽堿脅迫對(duì)大豆幼苗植株的生長(zhǎng)影響，并且這些形態(tài)學(xué)指標(biāo)與植株的莖粗、株高、地上部鮮/干重等具有顯著的正相關(guān)性。在后續(xù)的試驗(yàn)中，可將植株的光合參數(shù)、熒光參數(shù)、生理學(xué)參數(shù)與表型儀獲得的形態(tài)參數(shù)進(jìn)行深入的關(guān)聯(lián)分析，以綜合分析逆境脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的影響，以更好的服務(wù)于抗逆品種選育、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑開(kāi)發(fā)、栽培措施改良等研究。

4 結(jié)論

研究基于植物表型分析系統(tǒng)（Planteye F500），通過(guò)對(duì)鹽堿脅迫下兩種大豆品種的形態(tài)指標(biāo)、光譜特征參數(shù)和生物量數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合的定量分析，研究了鹽堿脅迫對(duì)大豆幼苗生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明鹽堿脅迫顯著的降低了大豆幼苗植株的地上/根系的生長(zhǎng)和生物量積累，使得株形變得更加緊湊，同時(shí)降低了植株的光合能力。同時(shí)，分析了大豆幼苗響應(yīng)鹽堿脅迫的主成分，并建立了相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性，明確了利用植物表型分析系統(tǒng)器獲得的形態(tài)參數(shù)可以作為新的指標(biāo)應(yīng)用于大豆響應(yīng)鹽堿脅迫的研究。