陳鈺涵，陳 穗，羅 勇，王水金，郭佳銘，林柏先，劉 靜，2

（1．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院機能學(xué)實驗室，廣東 汕頭 515041；2．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041）

周圍神經(jīng)損傷是臨床上常見的一類疾病，若未能及時有效地接受神經(jīng)修復(fù)和康復(fù)治療，患者的感覺和運動功能將會受損，甚至喪失工作和生活能力[1]。而牽拉損傷是一種特殊的周圍神經(jīng)急性損傷類型，嚴重的牽拉損傷可引起失神經(jīng)支配導(dǎo)致不可逆的功能障礙[2]。某些手術(shù)容易引起神經(jīng)牽拉損傷，如甲狀腺腺葉切除術(shù)、腰椎間盤切除術(shù)等[3-4]。此外，牽拉伸長神經(jīng)在一些手術(shù)操作中必不可少，如神經(jīng)延長術(shù)和肢體延長術(shù)等[5-6]。因此，神經(jīng)牽拉損傷也是這類手術(shù)的重要并發(fā)癥，若外科手術(shù)中牽拉使神經(jīng)張力過大將導(dǎo)致神經(jīng)損傷，從而影響神經(jīng)的修復(fù)與功能，而預(yù)防神經(jīng)牽拉損傷的關(guān)鍵在于明確神經(jīng)能夠耐受牽拉的程度。本研究使用牛蛙坐骨神經(jīng)作為研究對象，建立簡便、可量化的神經(jīng)牽拉損傷模型，探究牽拉對蛙坐骨神經(jīng)動作電位的影響及坐骨神經(jīng)能夠耐受的牽拉程度，為臨床手術(shù)中神經(jīng)牽拉損傷的研究提供動物模型的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

牛蛙60只，年齡、雌雄不限，健康，體質(zhì)量約200 g，由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院機能學(xué)實驗室提供。

1.2 主要儀器和試劑

常用蛙類手術(shù)器械、經(jīng)典神經(jīng)干屏蔽盒、BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）、艾德堡HP-5N推拉力計及HLA螺旋機架（樂清市艾德堡儀器有限公司）、任氏液（自配）。

1.3 蛙坐骨神經(jīng)干牽拉裝置

HP-5N推拉力計固定于配套的HLA螺旋機架上，轉(zhuǎn)動螺旋機架的轉(zhuǎn)盤可使推拉力計勻速上升或下降。在推拉力計下方的小鐵鉤加套一條小塑膠管（圖1），使鉤子牽拉神經(jīng)干的接觸面積增大，同時避免金屬對神經(jīng)干的影響。牛蛙毀髓后剪開大腿部皮膚，用玻璃分針沿坐骨神經(jīng)溝游離出坐骨神經(jīng)。用蛙足釘穿過蛙的髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)，避開坐骨神經(jīng)，將蛙固定在蛙板上，置于推拉力計下方。推拉力計調(diào)零后，使其鉤子勾住坐骨神經(jīng)干的中段，轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)盤，緩慢勻速地向上牽拉神經(jīng)干。當(dāng)推拉力計顯示拉力到達目標拉力值后，維持拉力不變持續(xù)30 s。實驗過程中在神經(jīng)干表面滴加任氏液保持濕潤。

圖1 蛙坐骨神經(jīng)干牽拉實驗裝置示意圖

1.4 蛙坐骨神經(jīng)干動作電位相關(guān)指標的測量

牽拉后的坐骨神經(jīng)干兩端結(jié)扎后剪斷，離體，長度約6～7 cm，在任氏液中浸泡10 min后，置于神經(jīng)干屏蔽盒中且使神經(jīng)干頭端位于刺激輸出電極一側(cè)，尾端位于記錄電極一側(cè)（圖2）。蓋上屏蔽盒蓋子，開始運行系統(tǒng)模塊：（1）最適刺激強度，程控單刺激，波寬0.05 ms，延時5 ms，采樣率50 kHz，刺激強度從0開始，增量為0.02 V；（2）不應(yīng)期，起始波間隔8 ms，減量為0.2 ms，刺激時間間隔2 s，刺激強度2 V；（3）雙電極法測神經(jīng)干動作電位傳導(dǎo)速度，刺激強度2 V，見圖3。

圖3 蛙坐骨神經(jīng)干動作電位相關(guān)指標的測量

1.5 牽拉處理分組

將60只牛蛙的120根坐骨神經(jīng)隨機分為12組，每組10根，區(qū)分左右。其中一組為對照組，將神經(jīng)干離體后在任氏液中浸泡10.5 min，之后測量相關(guān)指標。其余為實驗組，各組體神經(jīng)干分別以0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2 N的拉力牽拉30 s，之后將神經(jīng)干離體，于任氏液中浸泡10 min后測量相關(guān)指標。根據(jù)需要加做0.1、0.2、0.3 N組。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

將BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)的數(shù)據(jù)導(dǎo)出，整理出各組標本的動作電位幅度、絕對不應(yīng)期、神經(jīng)干傳導(dǎo)速度。采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以[M（Q1，Q3）]表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同牽拉力對蛙坐骨神經(jīng)干完整性及活性的影響

牽拉力＜2.8 N時，神經(jīng)干未斷裂。牽拉力為2.8 N時，有2條神經(jīng)干引導(dǎo)出的動作電位幅度為0 mV，其余神經(jīng)干可引導(dǎo)出一定幅度的雙相動作電位。而牽拉力為3.2 N時，該組所有神經(jīng)干均斷裂。

2.2 不同牽拉力對蛙坐骨神經(jīng)干動作電位波形的影響

選擇各組中有代表性（各項指標接近平均值）的動作電位波形進行比較。牽拉力不超過2.8 N時，隨著刺激強度增大，動作電位波形表現(xiàn)為幅度降低、波寬增大、波峰與刺激起點的時間間隔增大；牽拉力達到3.2 N時，無動作電位產(chǎn)生。見圖4。

圖4 不同牽拉力作用對蛙坐骨神經(jīng)干動作電位波形的影響

2.3 不同牽拉力對蛙坐骨神經(jīng)干動作電位各項指標的影響

采用0～0.4 N的牽拉力處理蛙坐骨神經(jīng)干，發(fā)現(xiàn)動作電位的傳導(dǎo)速度顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05），見表1。進一步加大牽拉力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了2.8 N處理組，其他組動作電位的刺激閾值與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＞0.05）；對于絕對不應(yīng)期，2.4、2.8 N處理組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05）；而動作電位幅度及傳導(dǎo)速度均隨著牽拉力的增大而逐漸減少（P值均＜0.05）。見圖5。

表1 不同牽拉力對蛙坐骨神經(jīng)干傳導(dǎo)速度的影響

圖5 不同牽拉力對蛙坐骨神經(jīng)干動作電位的影響

3 討論

周圍神經(jīng)牽拉損傷是臨床常見的疾病，嚴重的神經(jīng)牽拉損傷可導(dǎo)致不可逆的感覺及運動功能障礙。對周圍神經(jīng)牽拉損傷進行定量研究將有助于明確神經(jīng)可耐受的牽拉程度。本研究中，0.4 N的牽拉力對神經(jīng)干的動作電位幅度未產(chǎn)生顯著影響，0.8 N以上的牽拉力才能降低神經(jīng)干的動作電位幅度，而0.1 N的牽拉力則足以使神經(jīng)干的動作電位傳導(dǎo)速度降低，這表明與動作電位幅度相比，傳導(dǎo)速度的變化對牽拉損傷更為敏感。因此，推測0.1～0.4 N的牽拉力與≥0.8 N的牽拉力造成神經(jīng)損傷的機制不同。

根據(jù)神經(jīng)結(jié)構(gòu)受損情況，Sunderland將神經(jīng)損傷分為5個級別。Ⅰ級：髓鞘中斷，軸突連續(xù)性完好；Ⅱ級：軸突及其髓鞘失去連續(xù)性，神經(jīng)的各種結(jié)締組織即神經(jīng)內(nèi)膜、神經(jīng)外膜和神經(jīng)束膜得以保留；Ⅲ級：軸突和神經(jīng)內(nèi)膜受損，但神經(jīng)束膜未受損；Ⅳ級：軸突、神經(jīng)內(nèi)膜和神經(jīng)束膜受損，但神經(jīng)外膜保留；Ⅴ級：神經(jīng)斷裂[7-8]?？梢?，髓鞘是神經(jīng)最早、最易損傷的結(jié)構(gòu)。脊椎動物神經(jīng)產(chǎn)生的動作電位依賴郎飛結(jié)進行快速的跳躍性傳導(dǎo)，而髓鞘化的軸突是形成郎飛結(jié)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[9]，髓鞘損傷將導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)速度降低[10]。因此，本研究中0.1～0.4 N的牽拉力對神經(jīng)干造成的損傷可能屬于Sunderland Ⅰ級，僅造成了神經(jīng)干內(nèi)軸突髓鞘損傷或中斷從而引起傳導(dǎo)速度減慢，而軸突的連續(xù)性保留使動作電位得以正常產(chǎn)生。0.8 N以上的牽拉力造成的神經(jīng)損傷可能屬于Sunderland Ⅱ級，由于軸突的斷裂，部分神經(jīng)纖維在刺激電極處產(chǎn)生的動作電位無法傳導(dǎo)至接收電極，使神經(jīng)干動作電位幅度降低。3.2 N的牽拉力使神經(jīng)干完全斷裂，屬于Sunderland Ⅴ級損傷。

0.4～2.0 N的牽拉力對絕對不應(yīng)期沒有明顯影響，而2.4 N的牽拉力則引起絕對不應(yīng)期的明顯延長。與此類似的是刺激閾值，2.8 N的牽拉力才足以引起刺激閾值的增大。且絕對不應(yīng)期與刺激閾值隨牽拉力變化的曲線非常相似。絕對不應(yīng)期是神經(jīng)細胞在發(fā)生一次興奮后細胞膜鈉通道失活的時期，之后鈉通道開始復(fù)活[11]。刺激閾值主要與細胞膜中鈉通道的密度和功能狀態(tài)以及細胞外的鈣離子濃度有關(guān)。本實驗中絕對不應(yīng)期和刺激閾值在牽拉力較大時也無明顯變化，原因可能是牽拉后部分未斷裂軸突的離子通道的密度和功能仍正常，動作電位在這些“幸存”的軸突中能正常產(chǎn)生并被接受電極記錄。本研究的不足之處在于未能在細胞水平觀察不同程度牽拉力造成的神經(jīng)損傷病理變化，對神經(jīng)損傷的量化局限于神經(jīng)功能水平，對損傷引起的神經(jīng)結(jié)構(gòu)的改變?nèi)杂写M一步研究。

目前國內(nèi)外對周圍神經(jīng)損傷的研究多為探討其損傷后的病理學(xué)改變或修復(fù)機制，且絕大多數(shù)所用的模型為大鼠或家兔。用無齒輸精管分離鉗在體牽拉大鼠或家兔的坐骨神經(jīng)至神經(jīng)延長1倍長度并持續(xù)30 s[12-14]，使用高精度測力計以0.2 N的拉力在體牽拉大鼠的海綿體神經(jīng)[15]。上述牽拉神經(jīng)干的方法多為一次性的牽拉，不能用于定量研究牽拉程度對神經(jīng)的損傷情況。

本研究利用定量研究的方法探討了牽拉力對蛙坐骨神經(jīng)干的損傷程度。蛙坐骨神經(jīng)干在2.8 N以下的牽拉力作用下可保持形態(tài)完整，3.2 N牽拉力則可使神經(jīng)干發(fā)生斷裂。蛙坐骨神經(jīng)干動作電位的不同指標對牽拉損傷的耐受程度不同，傳導(dǎo)速度對牽拉損傷最敏感，0.1 N的牽拉力即可降低傳導(dǎo)速度。當(dāng)牽拉力達到0.8 N時，動作電位幅度才開始降低。這可能是因為0.1～0.4 N的牽拉力只造成神經(jīng)髓鞘損傷而引起傳導(dǎo)速度的減慢，0.8 N以上的牽拉力則可造成神經(jīng)干內(nèi)軸索斷裂而降低復(fù)合動作電位幅度。刺激閾值和絕對不應(yīng)期則對牽拉損傷的耐受程度較高。本研究的蛙坐骨神經(jīng)牽拉損傷模型量化了牽拉力對坐骨神經(jīng)動作電位相關(guān)指標的影響。