張洪祿，滕 悅，湯唯艷，湯依群，吳劍秋

（1.江蘇省腫瘤醫(yī)院內(nèi)科，江蘇 南京 210000；2.中國藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210000）

非特指性外周T 細(xì)胞淋巴瘤（PTCL-NOS）是外周T 細(xì)胞淋巴瘤（PTCL）中最常見的類型，超過30%的PTCL 患者被歸類于PTCL-NOS[1]。由于PTCL-NOS 具有高度異質(zhì)性和耐藥性，目前所采用的一線方案是沿襲B 細(xì)胞淋巴瘤治療方案而來，絕大部分治療方案缺乏高水平的證據(jù)或生物學(xué)基礎(chǔ)[2]。雖然近年來不斷有針對PTCL-NOS 的新藥面世，但此類患者與B 細(xì)胞淋巴瘤患者相比仍存在預(yù)后差、復(fù)發(fā)率高的問題，因此闡明PTCL-NOS 的分子機(jī)制和尋找有效藥物對該病的治療尤為重要。近年來，生物信息學(xué)技術(shù)在確定疾病潛在的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)、信號途徑，疾病診斷和疾病發(fā)生的預(yù)測等多方面發(fā)揮著越來越重要的作用。本研究使用R 語言軟件與在線生物信息學(xué)分析工具，篩選影響PTCL-NOS 的關(guān)鍵信號通路和差異表達(dá)基因，并對可能對PTCL-NOS 產(chǎn)生治療作用的藥物進(jìn)行篩選，以期為PTCL-NOS 的研究和治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 GEO 基因芯片的獲取和分析 登錄美國國立生物中心基因數(shù)據(jù)庫（NCBI-GEO）網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），將篩選研究類型設(shè)置為expressionprofilingbyarray，篩選種屬為homospiens，檢索詞為expression data from PTCL 后，檢索到GSE132550 芯片數(shù)據(jù)集，GSE132550 芯片數(shù)據(jù)集中包含了68 個(gè)PTCL-NOS 患者的樣本，18 個(gè)Lennert淋巴瘤患者樣本和16 個(gè)來自于健康志愿者T 細(xì)胞的樣本。下載GSE132550 的表達(dá)譜（.txt 格式文件）和相關(guān)臨床信息（.soft 格式文件）。應(yīng)用GPL18281平臺對其進(jìn)行表達(dá)譜注釋分析。選取GSE132550 芯片數(shù)據(jù)集中PTCL-NOS 和健康志愿者的樣本進(jìn)行進(jìn)一步研究。

1.2 差異基因表達(dá)分析 通過R 語言對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量分析和標(biāo)準(zhǔn)化處理。為提高差異基因分析的準(zhǔn)確性，將差異基因分析閾值設(shè)定為|Log2FC（foldchange）|＞4，P＜0.01。在R 語言中加載附加模塊Limma 包和affyPLM 包，對PTCL-NOS 樣本和健康T 細(xì)胞樣本進(jìn)行差異基因的表達(dá)分析[3]。

1.3 基因本體論與KEGG 途徑富集分析 將之前所獲得的差異基因上傳至生物信息學(xué)微陣列分析數(shù)據(jù)庫DAVID（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）以獲得基因本體論（GO）和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路的分析結(jié)果。GO 的結(jié)果包括生物學(xué)的3 個(gè)方面：細(xì)胞構(gòu)成（cell components，CC）、分子功能（molecular functions，MF）和生物學(xué)過程（biological processes，BP）。

1.4 差異基因的蛋白質(zhì)交互網(wǎng)絡(luò)富集分析 STRING（11.0 版）（https://string-db.org/） 是一個(gè)在線數(shù)據(jù)庫，包含已知和預(yù)測的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相交互用（PPI）[4]。將所有差異基因上傳到STRING 中，并將最小交互分?jǐn)?shù)設(shè)置為0.9（最高條件）以上作為顯著閾值。將所獲得的PPI（.TSV 格式文件）上傳到Cytoscape 軟件以構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)[5]。隨后，采用Cytoscape 軟件內(nèi)的分子復(fù)合物檢測（MCODE）-app技術(shù)來識別關(guān)鍵基因間的連接網(wǎng)絡(luò)。MCODE 中的所有參數(shù)設(shè)置為default。

1.5 藥物-基因相互作用分析 DGIdb（https://www.dgidb.org）是一個(gè)基于數(shù)十個(gè)可信數(shù)據(jù)庫的，用于篩選分析藥物-基因相互作用的在線數(shù)據(jù)庫[6]。將MCODE 獲得的關(guān)鍵基因上傳到DGIdb 中，以搜索現(xiàn)有的藥物-基因相互作用，并利用與藥物匹配的關(guān)鍵基因進(jìn)行功能富集分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有的統(tǒng)計(jì)分析均由R 軟件（4.0.2）進(jìn)行，整個(gè)分析流程見圖1。

圖1 數(shù)據(jù)分析流程

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因的獲取 用R 軟件分析GSE132550 數(shù)據(jù)集中PTCL-NOS 樣本和健康T 細(xì)胞樣本，根據(jù)|Log2FC|＞4，P＜0.01 的篩選標(biāo)準(zhǔn)，共獲得1139 個(gè)存在差異表達(dá)的基因，其中包括670 個(gè)上調(diào)基因和469 個(gè)下調(diào)基因，見圖2。

圖2 1139 個(gè)差異基因的火山圖

2.2 GO 與KEGG 信號通路的富集分析 將所有的差異基因上傳到DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO 富集分析，得到差異基因的主要富集項(xiàng)目，包括KEGG 信號通路、BP、CC 和MF。在KEGG 信號通路中差異基因主要富集于PI3K-AKT 信號通路，細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用通路和阿米巴病相關(guān)信號通路，見圖3；BP注釋中差異基因主要存在于細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織和細(xì)胞連接組件，見圖4；CC 注釋中差異基因主要涉及膠原蛋白-細(xì)胞外間質(zhì)、基底膜和膠原三聚體的組成成分，見圖5；MF 注釋中差異基因與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、生長因子結(jié)合和膠原蛋白結(jié)合密切相關(guān)，見圖6。

圖3 KEGG 信號通路富集結(jié)果

圖4 BP 富集結(jié)果

圖5 CC 富集結(jié)果

圖6 MF 富集結(jié)果

2.3 PPI 富集分析 將1139 個(gè)差異基因上傳到STRING 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI 富集分析，得到包含552 個(gè)基因節(jié)點(diǎn)和1888 條連線的PPI 網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape軟件中的MCODE-app 篩選出包含顯著差異基因的模塊，交互模塊（分?jǐn)?shù)：15.655）涉及30 個(gè)基因節(jié)點(diǎn)和227 條連線，模塊中的差異基因主要包含在G 蛋白偶聯(lián)受體信號通路、胞外區(qū)和質(zhì)膜中，見圖7。

圖7 30 個(gè)顯著基因組成的蛋白交互網(wǎng)絡(luò)

2.4 藥物與基因的相交互用及潛在基因功能富集分析 將2.3 中模塊1 的30 個(gè)MCODE 基因上傳到DGIdb 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行藥物-基因相交互用分析，在篩選出與基因存在特定交互關(guān)系的藥物后，發(fā)現(xiàn)了105 個(gè)藥物靶向9 個(gè)特定基因（其中包括90 種針對ADRA2A 的藥物），所有的藥物都有其初始適應(yīng)證，見表1；這些基因主要富集在G 蛋白偶聯(lián)受體信號通路（BP）、質(zhì)膜（CC）和神經(jīng)活性配體-受體相交互用（KEGG 通路），見圖8、表2。

圖8 9 個(gè)存在藥物-基因相交互用的基因富集弦圖

表1 基因-藥物相互作用

表2 具有基因-藥物交互結(jié)果的9 個(gè)基因富集分析

3 討論

PTCL-NOS 是PTCL 最常見的亞型，通常表現(xiàn)出侵襲的臨床過程且分子機(jī)制尚未完全闡明[7]。幾乎所有PTCL-NOS 的治療方案都缺乏高水平的證據(jù)、分子或生物學(xué)基礎(chǔ)[8]。目前，其一線治療方案主要來源于侵襲性B 細(xì)胞淋巴瘤的治療方案，存在復(fù)發(fā)率高、遠(yuǎn)期療效差等問題[9]。近年來，隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展，許多疾病的分子特征和靶向藥物的發(fā)現(xiàn)，為個(gè)體化治療提供了可能。本研究旨在通過對PTCL-NOS 基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析，采用生物信息學(xué)方法尋找TCL-NOS 關(guān)鍵基因和靶向藥物。

本研究發(fā)現(xiàn)，PTCL-NOS 患者的部分KEGG 信號通路活動發(fā)生了明顯改變，其中PI3K-Akt 信號通路的改變最為顯著，共有36 個(gè)包含在該通路內(nèi)的基因發(fā)生了表達(dá)改變。磷脂酰肌醇-3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKTe）/雷帕霉素（mTOR）信號通路的哺乳動物靶點(diǎn)在包括代謝、凋亡、血管生成和細(xì)胞增殖在內(nèi)的生物調(diào)節(jié)中起著重要作用，也是人類癌癥中最常見的失調(diào)信號通路之一[10]。PI3K 是磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）的脂類激酶。PIP3 是AKT的對接位點(diǎn)，通過激活下游效應(yīng)子mTOR 信號通路促進(jìn)細(xì)胞生長、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞運(yùn)動和存活[11]。PTEN 是PI3K 的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，能抑制PI3K 抑制腫瘤生長。在癌癥環(huán)境下，PTEN 的突變使其失去對PI3K 的調(diào)節(jié)能力，進(jìn)而失調(diào)下游通路[12]?？傊?，在癌癥中，PI3K/AKT/mTOR 通路的過度激活增強(qiáng)了營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和代謝酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞代謝改變，從而為腫瘤細(xì)胞的生長提供了合成代謝需求，同時(shí)也增加了腫瘤細(xì)胞的耐藥性[13]。

根據(jù)DGIdb 數(shù)據(jù)庫的基因-藥物相交互用分析，共有105 種治療PTCL-NOS 的潛在藥物（其中有90 種藥物針對ADRA2A），靶向9 個(gè)基因（ADRA2A、S1PR1、S1PR3、S1PR4、CP、FN1、APOE、SERPINA1、C3）。ADRA2A 被認(rèn)為是多種腫瘤細(xì)胞系的潛在調(diào)節(jié)因子[14]。SERPINA1 過表達(dá)顯著改善了癌細(xì)胞遷移、集落形成和對細(xì)胞凋亡的抵抗力[15]。APOE 可通過與膜受體結(jié)合介導(dǎo)循環(huán)脂蛋白和組織之間的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移[16]。APOE 可通過LR8 受體直接抑制循環(huán)髓源性抑制細(xì)胞的存活，并在激活免疫系統(tǒng)中發(fā)揮抗腫瘤作用[17]。FN1 在多種癌癥中上調(diào)，沉默F(xiàn)N1 可促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[18，19]。S1P-S1PRs 信號通路誘導(dǎo)免疫細(xì)胞從淋巴器官流入血液，從而影響抗腫瘤免疫反應(yīng)[20，21]。西尼莫得是一種高效的S1PRs拮抗劑，已被批準(zhǔn)用于治療多發(fā)性硬化癥，其安全性和有效性已被證實(shí)。另一種S1PRs 抑制劑芬戈莫德也證明了其治療癌癥的潛力[20]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)9 個(gè)與PTCL-NOS 有關(guān)的關(guān)鍵基因（ADRA2A、S1PR1、S1PR3、S1PR4、CP、FN1、APOE、SERPINA1、C3）和105 個(gè)FDA 批準(zhǔn)的藥物，如芬戈莫德、西尼莫得、氯化鋅、丙氯拉嗪等。另外PI3K-AKT 信號通路對于PTCL-NOS 疾病的作用也值得關(guān)注。但由于本研究獲得的關(guān)鍵基因和藥物是基于軟件統(tǒng)計(jì)處理和數(shù)據(jù)庫分析，它們是否能在PTCL-NOS 中發(fā)揮作用仍需進(jìn)一步的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。