高 晗，趙 貝

（大理大學基礎醫(yī)學院，云南 大理 671000）

在大腦中表達的葡萄糖轉運體有兩種，一種是包含非鈉依賴性葡萄糖轉運體（glucose transporter，GLUT），另一種是鈉依賴性GLUT。不同的GLUT 在大腦中不同位置和細胞中表達，以保證大腦正常的能量代謝。研究表明[1-3]，GLUT8 大腦中在皮質、小腦、下丘腦、海馬中均有表達，而在大鼠腦中，GLUT8在神經(jīng)元中普遍表達，但不在星形膠質細胞或者小膠質細胞中表達。雖然GLUT8 和GLUT3 都在神經(jīng)元上表達，但其表達的位置不同。GLTU8 定位在神經(jīng)元胞體和近端頂端樹突上，參與了海馬神經(jīng)元的能量供應[4]。在哺乳動物大腦發(fā)育過程中，GLUT8 表達增加可為大腦發(fā)育提供能量[5]。但目前尚未確定GLUT8 是否接受D-半乳糖、D-果糖、磷酸化單糖作為底物，同時GLUT8 在大腦中的生理功能、調節(jié)機制及病理生理影響尚不明確?；诖耍狙芯客ㄟ^在線軟件分析對GLUT8 的結構和功能進行生物信息學分析，以期為進一步研究GLUT8 在大腦中的生理功能、調節(jié)機制和病理生理機制提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料 通過美國國家生物技術信息技術中心NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nil.gov）對GLUT8 進行序列分析；登錄Uniprot 蛋白數(shù)據(jù)分析庫和NCBI 網(wǎng)站，獲取GLUT8 的基因序列和氨基酸序列。

1.2 生物信息學分析 ①理化性質分析：通過在線軟件Expasy 的ProtParam Pool 和ProtScale 分別對GLUT8 進行理化性質和親疏水性分析；②蛋白跨膜區(qū)域、亞細胞定位和細胞信號肽的預測：通過TMHMM（TMHMM Server V 2.0）和SignalP 4.1 對GLUT8對跨膜區(qū)域和信號肽預測；通過ProtCrop-Version對GLUT8 細胞定位分析；③蛋白糖基化分析：通過YinOYang 1.2 Server 分析GLUT8 的O-糖基化位點；通過NecNGlyc 1.0 Server 分析GLUT8 的N-糖基化位點；④蛋白磷酸化位點預測：通過NetPho3.1在線工具預測GLUT8 的磷酸化位點；⑤蛋白二、三級結構分析：通過在線工具SOPMA 分析GLUT8 的二級結構；另通過SWISS-MODEL 和UniProt 網(wǎng)址分析GLUT8 的三級結構；⑥蛋白相互作用分析：通過UniProt 的Inertation 數(shù)據(jù)庫對GLUT8 蛋白進行二元相互作用分析；另通過UniProt 的STRING 數(shù)據(jù)庫進行蛋白相互作用網(wǎng)絡分析。

2 結果

2.1 蛋白基因及編碼蛋白的基本信息 GLUT8 蛋白由SLC2A8 編輯，位于9q33.3，全長10 759 bp，包含11 個外顯子，477 個氨基酸。基因ID：29 988，基因組序列為NC-000009，蛋白質NP-055395.2。

2.2 蛋白質的理化性質及親疏水性分析 GLUT8 有477 個氨基酸，其中丙氨酸（Ala）占12.8%，亮氨酸（Leu）占13.8%，其他氨基酸的占比均小于10%。帶負電荷殘疾的天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）的總數(shù)為28，正電荷殘疾的精氨酸（Arg）和賴氨酸（Lys）的總數(shù)為29。相對分子質量為50 819.08。分子式為C2361H3665N587O661S24，原子總數(shù)為7298。不穩(wěn)定指數(shù)（Ⅱ）為41.07。理論等電點pⅠ為7.55。蛋白脂肪系數(shù)為110.25。通過ProtScale 獲得GLUT8 蛋白親疏水性氨基酸殘基的分布圖，結果顯示氨基酸親水性得分最大值為2.56，最小值為-3.33，標度值＞0 區(qū)域比＜0 區(qū)域密集；總平均親水性為（GRAVY）0.73，見圖1。

圖1 GLUT8 蛋白親水性分析

2.3 蛋白的跨膜區(qū)域以及亞細胞定位 TMHMM Server.2.0 工具在線分析顯示，GLUT8 蛋白有12 個跨膜結構域，見圖2。ProtCrop-Version 9 分析顯示，GLUT8 蛋白主要定位于細胞膜和細胞質內，見表1。SignalP 4.1 軟件在線分析顯示，GLUT8 蛋白信號肽中Cmax在42，為0.127；Ymax在42，為0.161；Smax在30，為0.262，見圖3。

表1 GLUT8 蛋白的亞細胞定位

圖2 GLUT8 蛋白的跨膜結構域分析

圖3 GLUT8 蛋白信號肽分析

2.4 蛋白的糖基化分析 GLUT8 蛋白有5 個O-糖基化位點，分別在47、333、350、356、360 位。N-糖基化分析顯示，GLUT8 蛋白有1 個N-糖基化位點，在349 位，見圖4、圖5。

圖4 GLUT8 蛋白O-糖基化分析

圖5 GLUT8 蛋白N-糖基化分析

2.5 蛋白的磷酸化位點分析 GLUT8 蛋白共有24 個磷酸位點，見圖6。其中，絲氨酸（Ser）磷酸化位點12個，蘇氨酸（Thr）磷酸化位點10 個，酪氨酸（Tyr）磷酸化位點2 個，見表2。

表2 GLUT8 蛋白磷酸化位點預測

圖6 GLUT8 蛋白磷酸化位點分析

2.6 蛋白的二級結構和三級結構分析 二級結構：采用SWISS MODEL 軟件分析GLUT8 蛋白的三維立體結構，該模型的GEMQ 評分為0.63 分，平均QMEAN 評分為（0.66±0.05）分，見圖7。三級結構：采用SPOMA 軟件分析GLUT8 蛋白的二級結構，其中α-螺旋（Hh）231 個，占48.43%；無規(guī)則卷曲（Cc）135 個，占28.3%；β 折疊（Ee）89 個，18.66%；β 轉角（Tt）22 個，占4.61%，見圖8。

圖7 GLUT8 蛋白三級結構分析

圖8 GLUT8 蛋白二級結構分析

2.7 蛋白的相互作用分析 GLUT8 蛋白共與46 個蛋白有二元相互作用，見圖9。蛋白相互作用網(wǎng)絡分析顯示，GLUT8 蛋白與10 個蛋白有相互作用，分別是SLC5A1、SLC23A1、FAM162A、MAP3K14、MRPS33、NPEPL1、CHSY3、AP2A1、AP2A2、AP2B1，見圖10。

圖9 GLUT8 蛋白二元相互作用網(wǎng)絡

圖10 GLUT8 蛋白相互作用網(wǎng)絡

3 討論

腦細胞不能儲存和合成葡萄糖，因此人腦幾乎完全依賴葡萄糖作為能量來源。大腦需要源源不斷的葡萄糖供應來維持腦細胞正?；顒?、神經(jīng)遞質的合成和神經(jīng)突觸形成[6]。而葡萄糖是一種極性大分子物質，不能通過單純擴散穿過質膜的雙層脂質層[7]，因此需要轉運載體進入細胞。GLUT 家族蛋白是糖轉運蛋白亞家族成員，現(xiàn)有14 個成員[5]，不同的GLUT 分布在不同的組織和細胞中，特定的GLUT 促進不同的底物進入細胞，如葡萄糖、果糖、肌醇等。GLUT8 是繼GLUT4 后第2 個由胰島素調節(jié)的葡萄糖轉運體[8]，具有高親和力葡萄糖轉運活性（Km=2 mmol/L）[9]。GLUT8 的底物現(xiàn)已確定的有葡萄糖[10]、海藻糖[11]、己糖[12]，海藻糖的攝入可以上調大腦中的GLUT8 的表達[13]，除葡萄糖外尚未確定這些底物的Km 值。除了在海馬體中高表達，GLUT8 還在學習和記憶、探索、恐懼、焦慮、多動等行為特征的腦區(qū)中發(fā)揮作用[14-17]。Schmidt S 等[18]在GLUT8 敲除小鼠中發(fā)現(xiàn)，小鼠表現(xiàn)為過度活躍且行為學實驗有明顯改變，這種改變是由GLUT8 引起的葡萄糖代謝障礙導致神經(jīng)元功能障礙的結果。另有實驗研究顯示[10]，GLUT8 可能是將葡萄糖從粗面內質網(wǎng)運輸?shù)郊毎|中，而且GLUT8 可能影響海馬的葡萄糖穩(wěn)態(tài)。海馬在大腦中具有至關重要的作用，而GLUT8在海馬的能量供應起著主要的調節(jié)作用，明確GLUT8 的生理功能和調節(jié)機制可能對神經(jīng)退行性疾病的研究有著重要意義。目前對于大腦中GLUT8的生理功能和調節(jié)機制的研究較少，因此利用生物信息學技術對GLUT8 進行分析和預測，有助于對GLUT8 在大腦的生理功能和調節(jié)機制進行研究。

在過去的幾十年中，使用高通量技術研究分子生物學系統(tǒng)已改變了生物學和生物醫(yī)學的研究，使研究人員能夠系統(tǒng)的研究生物體的基因組（基因組學）、一組RNA 分子（轉錄組學）和一組蛋白質，以及其結構和功能（蛋白質組學）[19]。因大多數(shù)生理和病理過程都表達在蛋白質水平上，現(xiàn)已開發(fā)了很多公開可用的數(shù)據(jù)庫和資源，以支持與蛋白質相關的信息管理和生物學知識的發(fā)現(xiàn)，可幫助研究人員快速尋找研究蛋白的相關信息學資源，為科研研究提供便利。本研究選取了一些常用的數(shù)據(jù)庫和資源對GLUT8 的蛋白特性、糖基化位點、磷酸化位點、與蛋白的二元相互作用及有相互作用的蛋白進行了預測，結果顯示GLUT8 蛋白由SLC2A8 編碼，位于9q33.3；全長10 759 bp，包含11 個外顯子，共477個氨基酸。GLUT8 為不穩(wěn)定疏水性蛋白，無信號肽，有12 個跨膜區(qū)域，二級結構以α-螺旋為主，定位于細胞膜和細胞質中。蛋白質的糖基化參與多個生物過程，影響蛋白特性，而有的蛋白需要糖基化才能正常的折疊和在細胞內穿行[20]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，GLUT8 有6 個糖基化位點，有利于其與不同底物結合，并攜帶底物在胞內遷移。GLUT8 磷酸化修飾主要參與細胞的信號轉導，對蛋白的活性和功能有重要的影響。本研究預測GLUT8 具有24 個磷酸化位點，推測其可能有多個作用位點和參與多條信號通路。現(xiàn)已確定的磷酸化位點為AMPK[21]，其他的磷酸化位點尚未見到報道。此外，預測的GLUT8 與46 個蛋白有二元相互作用，與10 個蛋白有相互作用，以上結果為進一步研究GLUT8 在腦內的生理功能和調節(jié)機制提供了理論依據(jù)。

綜上所述，GLUT8 為12 次跨膜蛋白，有多個糖基化位點和磷酸化位點，與多個蛋白相互作用，參與多條信號通路。