張林 侯艷紅 李春梅 劉浩潤

中國人民解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心消化內(nèi)科，北京 100091

【提要】 采用乳化聚合法制備負(fù)載吉西他濱(GEM)的納米微球(GEM-PBCA-NP)，應(yīng)用化學(xué)交聯(lián)法將抗黏液蛋白1(MUC1)單抗偶聯(lián)GEM-PBCA-NP。采用皮下種植法建立胰腺癌荷瘤裸鼠模型，并隨機分為MUC1-GEM-PBCA-NP組、GEM-PBCA-NP組、GEM組、單純納米顆粒組(PBCA-NP組)和對照組。結(jié)果顯示，MUC1-GEM-PBCA-NP組裸鼠移植腫瘤的抑制率顯著高于其他各組，治療結(jié)束時的移植腫瘤重量顯著低于其他各組。提示MUC1-GEM-PBCA-NP對裸鼠移植腫瘤具有良好的抑制生長作用。

胰腺癌是嚴(yán)重威脅國人健康與生命的一種惡性腫瘤，近年來發(fā)病率及死亡率呈快速上升的趨勢。胰腺癌早期無明顯癥狀，難以發(fā)現(xiàn)，確診時大多為進展期，又缺乏有效的治療手段，故預(yù)后極差[1-2]。因此針對晚期胰腺癌有效而不良反應(yīng)低的治療方法是目前研究的熱點。本課題組先期研究以抗表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)作為靶點，將抗EGFR抗體偶聯(lián)到載吉西他濱聚氰基丙烯酸正丁酯納米微球(EGFR-GEM-PBCA-NP)，用于治療胰腺癌移植瘤，結(jié)果顯示有一定的靶向性和抑瘤作用，但效果不甚理想[3-4]。近年來黏液蛋白1(mucin 1，MUC1)作為新的靶點進入了研究者的視野。因MUC1在胰腺癌組織的表達率高達80%[5-6]， 故本課題組將抗MUC1單克隆抗體偶聯(lián)到GEM-PBCA-NP，通過胰腺癌PANC1細(xì)胞株的體外實驗，顯示MUC1-GEM-PBCA-NP能抑制癌細(xì)胞的增殖[7]。本研究進一步行MUC1-GEM-PBCA-NP治療胰腺癌的動物體內(nèi)實驗。

一、材料與方法

1．MUC1-GEM-PBCA-NP制備：MUC1單抗購自Abnova公司。GEM-PBCA-NP的制備參考李春梅等[3]方法。將GEM-PBCA-NP與抗MUC1單克隆抗體完全混合溶于pH7.4的SBF溶液, 低速磁力攪拌下按一定比例加入碳二亞胺溶液, 混均后離心取沉淀。超聲分散沉淀物后，用去離子水洗滌4遍，冷凍干燥獲取抗MUC1單抗與GEM-PBCA-NP的交聯(lián)物(MUC1-GEM-PBCA-NP)。應(yīng)用激光散射粒度分析儀(Zeta sizer Nano ZS90型，英國馬爾文公司)觀察微球粒的大小及抗體的分布，計算包封率及載藥率。包封率=納米微球粒實際載藥量/總投藥量×100%；載藥率=納米微球粒實際載藥量/稱取的納米微球粒質(zhì)量×100%。

2．體內(nèi)抑瘤實驗：人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1由北京富眾科技發(fā)展有限公司提供,常規(guī)復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代。BALB/c裸鼠45只，5～6周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。參考馬琳等[8]及李春梅等[4]方法制備荷瘤裸鼠模型，即取0.2 ml(6×107/ml)PANC1細(xì)胞懸液注射于裸鼠右側(cè)腋部皮下，待瘤體最大徑>0.5 cm(需7～10 d)為建模成功。共39只裸鼠成功建模，按數(shù)字表法將其中35只隨機分為5組，每組7只。MUC1-GEM-PBCA-NP組，經(jīng)尾靜脈注射2.5 mg/kg吉西他濱(gemcita bine, GEM)等藥劑量的MUC1-GEM-PBCA-NP；GEM-PBCA-NP組，經(jīng)尾靜脈注射等藥劑量GEM-PBCA-NP；GEM組：經(jīng)尾靜脈注射GEM 2.5 mg/kg；單純納米顆粒組(PBCA-NP組)，經(jīng)尾靜脈注射等容積PBCA-NP；對照組，經(jīng)尾靜脈注射等容積生理鹽水。每5 d重復(fù)治療1次，每3 d測量1次腫瘤長徑(a)和短徑(b)，計算腫瘤體積(V)，V=a×b2/2。實驗開始后第15天及第30天上IVIS·Lumina LT小動物活體成像系統(tǒng)(美國PerkinElmer)行活體生物發(fā)光檢測成像并記錄，生物發(fā)光實驗參考王劍超等[9]方法。第30天處死裸鼠，剝離瘤體稱重，計算抑瘤率。抑瘤率=[(對照組瘤重-實驗組瘤重)/對照組瘤重]×100%。

二、結(jié)果

1．各組納米粒子電鏡下觀察結(jié)果：MUC1-GEM-PBCA-NP組電鏡下觀察制備的納米顆粒形態(tài)為光滑的球形，藥物GEM細(xì)顆粒均勻地分散在聚合物基質(zhì)中。GEM-PBCA-NP組和MUC1-GEMPBCA-NP組納米粒大小分別為(49.62±6.17)nm和(58.14±6.44)nm。 GEM-PBCA-NP組和MUC1-GEM-PBCA-NP組納米粒中GEM的包封率分別為(44.52±4.22)%、(47.19±3.63)%，載藥量分別為(7.24±0.71)%、(6.85±0.56)%。表面修飾后納米粒子并無明顯變化，表明MUC1-GEM-PBCA-NP靶向載藥納米粒子制備成功。

2．MUC1-GEM-PBCA-NP1的裸鼠移植瘤抑瘤效果：治療后30 d，MUC1-GEM-PBCA-NP組、GEM-PBCA-NP組、GEM組裸鼠的抑瘤率顯著高于PBCA-NP組及對照組，MUC1-GEM-PBCA-NP組抑瘤率又顯著高于GEM-PBCA-NP組、GEM組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)，而GEM-PBCA-NP組與GEM組抑瘤率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1，表1)。

圖1 各組裸鼠移植瘤的生長曲線

3．裸鼠移植腫瘤的光子量變化：MUC1-GEM-PBCA-NP組、GEM-PBCA-NP組、GEM組、PBCA-NP組及對照組治療前移植瘤基礎(chǔ)光子量均值分別為3.44±0.56、4.01±0.59、3.79±0.61、4.20±0.62、3.64±0.56，各組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；治療第15天移植瘤光子量均值分別為7.21±0.76、14.48±1.34、13.77±1.52、27.25±3.56、29.52±2.43，其中MUC1-GEM-PBCA-NP組顯著低于其余各組(P值均<0.05，圖2)，GEM-PBCA-NP組和GEM組又顯著低于PBCA-NP組和對照組(P值均<0.05)，其余組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；治療第30天移植瘤光子量均值分別為9.46±0.89、17.27±1.89、18.43±1.98、36.15±4.98、38.382±4.22，其中MUC1-GEM-PBCA-NP組顯著低于其余各組(P值均<0.05)，GEM-PBCA-NP組和GEM組也顯著低于PBCA-NP組和對照組(P值均<0.05)，其余組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。MUC1-GEM-PBCA-NP組給藥第15天和第30天的移植瘤光子抑制率分別為67.27%和74.29%。

圖2 治療15 d時MUC1-GEM-PBCA-NP組(2A)、GEM-PBCA-NP組(2B)、GEM組(2C)、PBCA-NP組(2D)及對照組(2E)裸鼠移植瘤的腫瘤生物活體發(fā)光成像圖

討論近年來納米載藥系統(tǒng)成為一個主要的研究方向。國內(nèi)外已經(jīng)有采用納米載藥系統(tǒng)進行胰腺癌治療的研究[10]，如金納米粒子、碳納米管、納米二氧化硅和超順磁性、氧化鐵納米粒子等無機納米粒子以及白蛋白納米粒子、殼聚糖納米粒子等有機納米粒子在胰腺癌診斷、治療方面已取得一定成績[11]，但仍有諸多問題需進一步解決，其中分子靶點問題是一個研究熱點。MUC是一類大分子量糖蛋白，在正常生理狀態(tài)下，MUC的表達具有明確的組織特異性和時間特異性[12]。在病理狀態(tài)下，MUC表達異常是許多疾病及腫瘤的特征，尤其在胰腺癌組織中，MUC1異常表達已被研究證實。已有研究以MUC1作為引導(dǎo)納米粒子的靶向分子，顯示在胰腺癌中具有良好的導(dǎo)向作用。張重捷等[13]制備了抗MUC1單克隆抗體靶向修飾的探針超順磁納米顆粒，體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，該納米顆?？梢赃x擇性地積聚在裸鼠移植瘤內(nèi)，可作為磁共振檢查時特異性顯影劑使用，提示MUC1作為靶點治療胰腺癌的可行性。因此本研究也采用抗MUC1單克隆抗體靶向修飾載GEM納米微粒的類似策略。

聚氰基丙烯酸正丁酯納米微粒(PBCA-NP)作為藥物載體具有顆粒大小適中，可避免內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)吞噬，快速分布于組織，具有優(yōu)良的藥物緩釋作用, 本課題組前期的體外細(xì)胞實驗已顯示其良好的載藥及藥物釋放作用[14-15]。本研究結(jié)果顯示，MUC1-GEM-PBCA-NP對于裸鼠胰腺癌移植瘤的抑制作用明顯優(yōu)于無抗體偶聯(lián)的GEM-PBCA-NP及GEM直接的藥物作用，而GEM-PBCA-NP與GEM的抑制作用未見明顯差異，提示抗MUC1單抗對于載GEM納米微粒的動物體內(nèi)導(dǎo)向作用較為顯著，與本課題組前期的體外實驗結(jié)果一致。本研究通過腫瘤生長曲線、腫瘤體重計算及活體生物發(fā)光顯像等方法評估MUC1-GEM-PBCA-NP的抑瘤效果，各方法總體結(jié)果基本一致，其中以腫瘤體重計算的MUC1-GEM-PBCA-NP組抑瘤率略低于活體生物發(fā)光光子量計算的抑瘤率，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，初步證實了抗MUC1單抗修飾的載GEM納米微球在動物模型體內(nèi)能夠通過血行轉(zhuǎn)運，克服內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)吞噬等諸多不利因素的影響而到達胰腺癌移植瘤組織內(nèi)，從而產(chǎn)生良好的抑制腫瘤生長的作用。

本研究是以模型動物為基礎(chǔ)的前臨床水平研究，結(jié)果具有局限性。納米微粒在人體內(nèi)的情況更為復(fù)雜，人體的組織結(jié)構(gòu)、血管淋巴管轉(zhuǎn)運、內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)以及更為重要的人體免疫系統(tǒng)作用都與免疫缺陷的裸鼠有很大不同。因此對納米微粒的優(yōu)化和在更為高等動物模型體內(nèi)實驗研究將是下一步研究的工作重點。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突