周銳 余運霖 焦鑫 余梟 高文哲 張先林

1三峽大學附屬仁和醫(yī)院普外科，宜昌 443001；2中南大學湘雅三醫(yī)院肝膽胰外科，長沙 410000

【提要】 通過TCGA數據庫中CCL2基因表達譜，對其差異表達基因(DEGs)做相關性分析，然后與臨床生存信息結合，經過建模驗證后獲得預后相關DEGs，進而探討DEGs部分基因的作用及對胰腺癌患者生存的影響。結果表明，CCL2相關性基因 在胰腺癌中扮演重要角色，其低表達與胰腺癌患者的預后成正相關。

趨化因子是一類由細胞分泌的小細胞因子或信號蛋白，具有誘導附近反應細胞定向趨化的能力[1]，是主導細胞遷徙的關鍵調節(jié)劑，對惡性腫瘤的發(fā)展有極大影響。CCL2是趨化因子CC亞家族中的重要成員，為促進單核細胞及巨噬細胞遷徙的關鍵因子之一，已經證實，CCL2在多種腫瘤發(fā)展進程中發(fā)揮作用[2-5]，通過抑制細胞凋亡、壞死和自噬等過程提高癌細胞的存活能力[6-8]，并在腫瘤微環(huán)境中與其受體相互作用，調節(jié)單核細胞的趨化性從而導致腫瘤的發(fā)展。然而，CCL2在胰腺癌中的作用機制尚不明確。本研究通過生物信息學分析CCL2及其相關差異表達基因，探討它們在胰腺癌組織中的表達及其與患者預后的相關性。

一、材料與方法

1．數據集的選擇：從腫瘤基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA,)數據庫下載178例胰腺癌患者的基因表達譜，從TCGA數據庫的連接網站UCSC XENA下載178例胰腺癌患者對應的完整臨床數據。

2．基因表達差異分析及相關性分析：根據CCL2基因表達量中位數，將178例患者分為高、低表達兩組，以logFC=1且P<0.05為標準，采用R/Bioconductor軟件的limma包對比篩選差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)。采用R軟件的corplot包對TCGA樣本與CCL2基因進行相關性分析，得到各個基因的相關系數，以相關系數的絕對值0.15為界限，選取相關基因與DEGs的交集，得到相關DEGs。根據178例患者的中位生存時間和生存狀態(tài)，采用R軟件的ezcox包進行批量COX回歸分析，以P<0.05為差異有統計學意義，篩選與預后相關的DEGs。

3．預后相關DEGs功能富集分析：使用R/Bioconductor軟件的clusterprofiler包對預后相關DEGs進行功能富集分析，包括基因本體(gene ontology,GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes,KEGG)通路富集分析，其中GO包括細胞成分、分子功能和生物學過程3個部分。

4．風險預測模型的建立與評估：采用R軟件的glmnet包，用Lasso方法篩選變量，建立Cox回歸模型，并計算基因的相關回歸系數，獲得預后相關DEGs模型。然后二次建模，根據回歸系數加權建立胰腺癌預后風險評估公式，繪制生存曲線和受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic, ROC)，計算曲線下面積(area under the curve, AUC)，并將預測模型可視化為列線圖。

5．統計學處理：采用R軟件(3.6.0版本)進行統計學分析。應用Wilcoxon秩和檢驗分析CCL2關鍵相關基因在胰腺癌組織中的差異表達，計量資料采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。基因間的相關性采用Spearman相關分析，0.1≤|r|≤1.0時定義為存在相關；生存曲線采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

二、結果

1．CCL2相關差異表達基因及功能和通路富集分析：通過差異分析及相關性分析，得到上調基因60個，下調基因304個，相關DEGs 223個(圖1A)。結合患者中位生存時間和生存狀態(tài)，進行多基因的COX回歸分析，得到與患者預后相關的DEGs 20個。GO功能富集分析和KEGG通路富集分析發(fā)現，20個DEGs主要富集對IL-1、TNF的應答和G蛋白偶聯受體結合位點上以及干細胞黏附分子、趨化因子信號通路上(圖1B、1C)。

圖1 胰腺癌CCL2相關差異表達基因的火山圖(1A)及胰腺癌CCL2相關差異表達基因功能富集圖(1B)和通路富集圖(1C)

2．預后相關DEGs風險模型及驗證：Lasso Cox回歸分析篩選得到12個基因，分別為VTCN1、RXRG、HSD11B1、RELN、LCN6、MUC15、C1S、CLDN10、TRARG1、CCL18、SLC7A10、ZNF831，其中VTCN1、HSD11B1、C1S為高風險基因；Kaplan-Meier單變量分析結果顯示，高風險基因與患者生存期短有關。根據回歸系數得到患者的風險評分，并將患者分為高、低風險組，Kaplan-Meier法進行生存分析結果顯示，兩組患者生存期差異有統計學意義(P<0.05)，高風險組患者生存期明顯縮短(圖2A)。預測模型的ROC曲線見圖2A，AUC值為0.716，表明該模型可預測胰腺癌患者的預后(圖2B)。將預測模型可視化為生存預測列線圖(圖2C)。

圖2 胰腺癌高、低風險組患者的生存曲線(2A)及生存預測的ROC曲線(2B)和列線圖(2C)

討論胰腺癌惡性程度高，預后差，了解其腫瘤免疫微環(huán)境，對疾病的干預和預后的判斷具有重要意義。有證據表明，高CCL2水平與更具侵襲性的惡性腫瘤、更高的轉移概率和更廣泛的癌癥預后相關[9]。CCL2在聚集腫瘤相關巨噬細胞中發(fā)揮作用，促使胰腺癌細胞重新改變其代謝途徑耐以生存，并使得胰腺癌細胞能夠在缺氧的條件下增殖[10-12]。本研究通過GO功能和KEGG通路富集分析發(fā)現，CCL2相關因子除了作用于常規(guī)趨化因子通路外，還聚集干細胞黏附、IL-1的免疫反應和G蛋白受體的結合，可能與腫瘤的浸潤、遠處轉移、逃離細胞免疫監(jiān)視等方面有關。根據CCL2相關性因子及Lasso Cox回歸分析篩選的12個建?；蛑?，ZNF831被報道富集于CD4+T細胞浸潤[13]，進而可能參與調控胰腺癌CD4+T細胞的基因表達；SLC7A10屬于溶質載體家族，其過表達降低了ROS生成并增加了線粒體呼吸的能力，促使脂肪細胞肥大，促進肥胖和胰島素抵抗，進而引起血糖的變化，使得胰腺癌的風險增加[14]；而同樣，作為趨化因子家族的CCL18也能促使腫瘤的轉移[15]；RXRG高表達會引起血脂的異常風險增加，而血脂和血糖的變化與胰腺癌有著密切關系[16]。CCL2由于能夠激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路，阻礙T細胞增殖，伴隨著持續(xù)的免疫抑制，通過促進髓源性抑制細胞(M-MDSCs)的免疫抑制能力，從而促使腫瘤生長和增殖[17]。血漿CCL2水平的升高是大腸癌復發(fā)的預測生物標志物[18]。趨化因子CCL2的表觀遺傳沉默抑制巨噬細胞浸潤以促進腫瘤的發(fā)展[19]。本研究結果顯示，相比低風險組患者，高風險患者生存期明顯縮短(P<0.05)；ROC曲線示該模型可以預測胰腺癌患者的預后。該模型基于各類基因的總體表達量，更符合當今的系統治療理念。

同時，本研究也存在一些缺陷。首先，本研究是通過生物信息學構建的預后預測模型，無外部的實驗數據驗證，臨床實際應用價值有限。其次，由于TCGA的樣本數量局限性，不能完整地闡述CCL2作用機制引起相關基因的差異性表達。最后，需要更多的病例數量獨立隊列研究來驗證。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突