余光書 林焱斌 莊福毅 吳春玲

血管在骨組織的修復(fù)過(guò)程起著重要作用，如果新血管形成不足可能會(huì)造成氧氣和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，從而導(dǎo)致骨組織修復(fù)的失敗[1]。新血管的再生多為內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）分化為內(nèi)皮細(xì)胞后再逐漸形成血管的過(guò)程，并且EPCs可以通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子或生物活性物質(zhì)參與這個(gè)過(guò)程[2-3]。因此，通過(guò)激活EPCs的活性及通過(guò)調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子分泌對(duì)于骨組織的修復(fù)具有重要意義。本研究結(jié)合既往使用補(bǔ)腎活血中藥“補(bǔ)骨顆?！睂?duì)骨組織損傷修復(fù)的良好效果，擬應(yīng)用補(bǔ)骨顆粒含藥血清干預(yù)EPCs，通過(guò)體外觀察成管實(shí)驗(yàn)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)，以期為進(jìn)一步研究補(bǔ)骨顆粒對(duì)骨組織損傷修復(fù)的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 含藥血清的制備

補(bǔ)骨顆粒中藥組成：骨碎補(bǔ)20 g，鹿銜草12 g，淫羊藿12 g，潞黨參15 g，茯苓20 g，三七3 g，川牛膝9g，當(dāng)歸9 g，川芎6 g，女貞子15 g，枸杞9 g，生地黃15 g，甘草3 g。補(bǔ)骨顆粒劑由廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院藥劑科負(fù)責(zé)加工制備，每克顆粒藥含原生藥9.8 g，使用時(shí)用生理鹽水加熱溶解。

將成年SD大鼠（購(gòu)于中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，編號(hào)：430727201101351783）按照隨機(jī)對(duì)照表分為空白對(duì)照組（10只）和實(shí)驗(yàn)組（10只），依據(jù)臨床常用量按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體表面積折算的等效劑量比值換算，將補(bǔ)骨顆粒用生理鹽水加熱溶解，制成1 g/ml的水溶液?？瞻讓?duì)照組予生理鹽水2 ml/kg灌胃，實(shí)驗(yàn)組予3.08 g/kg灌胃，1次/d，連續(xù)14 d，末次給藥后2 h處死大鼠，并在無(wú)菌條件下采腹主動(dòng)脈血5 ml，靜置2 h，低溫1 000 g離心15 min后分離血清，于56 ℃恒溫水浴滅活30 min，-80 ℃冰箱保存。

1.2 骨髓EPCs分離及培養(yǎng)

取10周齡的雄性SD大鼠（購(gòu)于中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，編號(hào)：1107272011004991），經(jīng)3%戊巴比妥鈉（上海上藥新亞藥業(yè)有限公司；國(guó)藥準(zhǔn)字H31021724；規(guī)格：1 ml∶100 g）腹腔注射麻醉成功后分離出大鼠四肢，剔除周圍肌肉組織，然后在無(wú)菌平皿中剪開(kāi)股骨兩端，使用10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培養(yǎng)基（SIGMA；貨號(hào)：D5796-500ML）反復(fù)沖洗髓腔，將所得的細(xì)胞懸液過(guò)200目細(xì)胞濾網(wǎng)，400g離心5 min收集細(xì)胞。然后緩慢加入到Percoll分離液的離心管中以500g離心30 min，吸取中間乳白色云霧狀有核細(xì)胞層，PBS沖洗3次后以400g離心10 min，將所得細(xì)胞用10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸，反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液后接種于中號(hào)培養(yǎng)瓶，置于37 ℃含5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后收集未貼壁細(xì)胞，換用EBM-2培養(yǎng)基接種于纖維粘連蛋白（FN）包被的培養(yǎng)皿中，于37 ℃含5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后首次換液，以后每3天換液1次。細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%融合后用含質(zhì)量百分比為0.125%胰酶及0.05%乙二胺四乙酸的消化液進(jìn)行消化，按1∶4傳代培養(yǎng)。

1.3 流式細(xì)胞學(xué)鑒定細(xì)胞表面抗原

將上述細(xì)胞傳代培養(yǎng)至14 d時(shí)，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，350g離心5 min，收集細(xì)胞，0.5%BSA-PBS洗細(xì)胞2次。應(yīng)用100 μl 0.5%的BSA-PBS重懸細(xì)胞沉淀，然后各管分別加入2 μl CD34-FITC抗體（Bioss；貨號(hào)：bs-0646RFITC）、1 μl CD133-FITC抗體（Bioss；貨號(hào)：bs-0395r-FITC）和1 μl VEGFR2-FITC抗體（Bioss；貨號(hào)：bs-0565r-FITC），同時(shí)設(shè)置不染抗體管，37 ℃避光孵育30 min；應(yīng)用0.5%的BSA-PBS洗細(xì)胞2次，350g離心5 min，再應(yīng)用350 μl 0.5%的BSA-PBS重懸細(xì)胞，然后應(yīng)用流式細(xì)胞儀（Beckman；型號(hào)：A00-1-1102）檢測(cè)，使用cellquest pro軟件進(jìn)行分析檢測(cè)。

1.4 補(bǔ)骨顆粒含藥血清及空白血清對(duì)成管實(shí)驗(yàn)的影響

收集上述傳代培養(yǎng)3代的EPCs，加入完全培養(yǎng)基，分別制備密度為2.0×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，并按2 ml/孔的原則接種于48孔板中，將其置于37 ℃含5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待每孔細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)，吸棄孔中原培養(yǎng)基并重新加入等體積的空白血清或補(bǔ)骨顆粒含藥血清干預(yù)24 h。分別收集上述細(xì)胞用0.25%胰酶[含0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）]將細(xì)胞消化下來(lái)，制成細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，用培養(yǎng)基制成4×104個(gè)/孔的細(xì)胞懸液，然后加入48孔板中（每孔加入100 μl基質(zhì)膠至均勻鋪滿孔）。于37 ℃孵育72 h時(shí)拍照觀察成血管情況。

1.5 Elisa方法檢測(cè)VEGF

在上述傳代培養(yǎng)3代的EPCs完全培養(yǎng)基，分為空白血清組（n=5）及補(bǔ)骨顆粒含藥血清組（n=5），加入等體積空白血清及補(bǔ)骨顆粒含藥血清進(jìn)行干預(yù)，分別于24、48及72 h時(shí)收集上述干預(yù)后的EPCs培養(yǎng)液作為檢測(cè)樣本。然后設(shè)空白孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測(cè)樣品10 μl。每孔加入酶標(biāo)試劑100 μl，空白孔除外。用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。每孔先加入顯色劑A 50 μl，再加入顯色劑B 50 μl，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μl以終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將Elisa方法檢測(cè)的VEGF數(shù)值采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。兩組同一時(shí)間點(diǎn)的對(duì)比采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；同一指標(biāo)組間兩兩比較采用單因素方差分析，當(dāng)方差齊性時(shí)應(yīng)用LSD方法檢驗(yàn)，當(dāng)方差不齊時(shí)應(yīng)用Tamhane’sT2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞表型分析

將細(xì)胞傳代培養(yǎng)至14 d時(shí)收集細(xì)胞，使用流式細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)提示CD34+細(xì)胞比例為70.03%，CD133+細(xì)胞比例為67.99%，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR2+）細(xì)胞比例為63.96%。

2.2 空白血清組與補(bǔ)骨顆粒含藥血清組體外基質(zhì)膠血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比

空白血清組與補(bǔ)骨顆粒含藥血清組細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基中于24 h內(nèi)呈索狀生長(zhǎng)，補(bǔ)骨顆粒含藥血清組于72 h后細(xì)胞形態(tài)趨于典型，呈毛細(xì)血管腔樣結(jié)構(gòu)；而空白血清組未形成典型的毛細(xì)血管腔樣結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖1。

2.3 空白血清組與補(bǔ)骨顆粒含藥血清組VEGF表達(dá)量對(duì)比

補(bǔ)骨顆粒含藥血清組在干預(yù)24 h時(shí)的VEGF表達(dá)量明顯高于空白血清組（t=3.069，P=0.037），在干預(yù)48 h時(shí)的VEGF表達(dá)量也明顯高于空白血清組（t=2.939，P=0.042）；但在干預(yù)72 h時(shí)補(bǔ)骨顆粒含藥血清組與空白血清組VEGF表達(dá)量對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.541，P=0.064）。補(bǔ)骨顆粒含藥血清組在干預(yù)24、48、72 h時(shí)的VEGF表達(dá)量對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.684，P=0.523），而空白血清組在干預(yù)24、48、72 h時(shí)的VEGF表達(dá)量明顯升高（F=5.656，P=0.019），見(jiàn)表 1。

表1 空白血清組與補(bǔ)骨顆粒含藥血清組VEGF表達(dá)量對(duì)比

3 討論

血管新生是機(jī)體從已有的毛細(xì)血管網(wǎng)基礎(chǔ)上，通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和出芽方式形成新的毛細(xì)血管的過(guò)程，對(duì)于組織的修復(fù)起重要作用。由于EPCs具備自我更新和分化能力，在一定條件下可誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，所以近年通過(guò)研究EPCs在不同條件下對(duì)血管新生影響的研究也越來(lái)越多[4]。另外，自從研究者們發(fā)現(xiàn)血管EPCs在體外合適的培養(yǎng)條件下具有形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的能力，因此EPCs體外成血管實(shí)驗(yàn)由此被廣泛應(yīng)用于血管新生的研究[5]。本研究在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用補(bǔ)骨顆粒含藥血清對(duì)EPCs進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)成血管實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞具有形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的能力，并且這種能力在一定條件下受到補(bǔ)骨顆粒含藥血清的促進(jìn)作用。

EPCs是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，其主要存在于臍帶血、外周血及骨髓等，而骨髓內(nèi)的EPCs在內(nèi)源性或外源性刺激因素作用下分化為內(nèi)皮細(xì)胞是參與血管新生的主要方式。本研究發(fā)現(xiàn)EPCs能夠分化為內(nèi)皮細(xì)胞且參與血管新生，這與目前研究發(fā)現(xiàn)EPCs能夠促進(jìn)血管網(wǎng)的形成從而促進(jìn)骨組織的形成一致[6]。但是，目前對(duì)于其促進(jìn)血管新生的方式仍存在一定的爭(zhēng)議。比如有研究認(rèn)為EPCs主要通過(guò)直接分化為內(nèi)皮細(xì)胞而參與血管新生，也有研究認(rèn)為其主要通過(guò)細(xì)胞因子影響血管的新生[7]。而機(jī)體中的血管新生受全身性和局部產(chǎn)生的信號(hào)的影響，本研究沒(méi)有進(jìn)一步從體內(nèi)分開(kāi)研究細(xì)胞因子對(duì)局部血管新生的影響，這對(duì)于討論EPCs促進(jìn)血管新生的機(jī)制存在一定的不足，今后可進(jìn)一步從EPCs對(duì)體內(nèi)血管新生的影響及局部細(xì)胞因子干預(yù)后血管新生情況進(jìn)行研究。

VEGF是一種分子量在3 445 kDa的分泌性二聚體糖蛋白，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有促進(jìn)分裂和抗凋亡作用，還可增加血管通透性，促進(jìn)細(xì)胞遷移，對(duì)血管生成過(guò)程中起積極作用，對(duì)EPCs的生長(zhǎng)也存在重要作用[8]。而VEGF的生物學(xué)效應(yīng)主要通過(guò)與VEGFR結(jié)合，從而激活細(xì)胞膜激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)信號(hào)并將其傳遞到細(xì)胞核，引起細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)的改變而影響血管通透性，并最終形成新生血管[9]。目前，大量文獻(xiàn)已報(bào)道了通過(guò)持續(xù)提供VEGF或保持較高濃度的VEGF，將會(huì)促進(jìn)血管的新生及骨組織的增生[10-11]。但是，VEGF的半衰期較短，容易在機(jī)體內(nèi)擴(kuò)散水解，從而導(dǎo)致單位體積內(nèi)的VEGF濃度降低而影響其生物學(xué)效應(yīng)[12]。因此，通過(guò)基因技術(shù)或外源性刺激因素提高VEGF表達(dá)量將是目前研究的重點(diǎn)[9，13]。本研究結(jié)合既往補(bǔ)骨顆粒對(duì)骨組織損傷修復(fù)具有良好效果的基礎(chǔ)上，通過(guò)應(yīng)用補(bǔ)骨顆粒含藥血清干預(yù)EPCs后也發(fā)現(xiàn)其對(duì)VEGF表達(dá)具有一定影響，這對(duì)進(jìn)一步了解補(bǔ)骨顆粒對(duì)骨組織的修復(fù)影響具有重要意義。由于本研究并未進(jìn)一步探討補(bǔ)骨顆粒對(duì)VEGF表達(dá)影響的具體機(jī)制，這對(duì)于研究存在一定的不足。但是，補(bǔ)骨顆粒主要由補(bǔ)腎活血中藥組成，既往研究發(fā)現(xiàn)其具有改善局部氧含量及激活細(xì)胞活性的作用[14]。因此今后可以從補(bǔ)骨顆粒對(duì)氧濃度及缺氧誘導(dǎo)因子-α（HIF-α）信號(hào)途徑的影響來(lái)探討VEGF表達(dá)的動(dòng)力學(xué)機(jī)制。

本研究通過(guò)應(yīng)用補(bǔ)骨顆粒含藥血清干預(yù)EPCs后發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨顆粒含藥血清可以激活EPCs的活性，促進(jìn)VEGF表達(dá)，從而增強(qiáng)EPCs的血管生成作用，這為進(jìn)一步研究補(bǔ)骨顆粒對(duì)骨組織損傷修復(fù)的機(jī)制提供有效理論依據(jù)。