阮湘梅，楊子明，李普旺*，張怡，周闖，何祖宇，劉運(yùn)浩，宋書會，王超*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350000）（2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所，廣東湛江 524091）（3.閩臺特色海洋食品加工及營養(yǎng)健康教育部工程研究中心，福建福州 350002）

隨著經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，人們對果蔬新鮮的需求也隨之提高。果蔬保鮮技術(shù)的發(fā)展對果蔬在運(yùn)輸過程中和貨架期中保持新鮮是至關(guān)重要的，如何保持果蔬采后的新鮮和防止果蔬腐敗是該領(lǐng)域面對的難題。涂膜保鮮是在果蔬表面形成一種有阻隔性的膜，來調(diào)控果蔬的呼吸，隔離有害微生物，提高保鮮效果。涂膜保鮮是在果蔬表面形成一種有阻隔性的膜，來調(diào)控果蔬的呼吸，阻隔有害微生物，提高保鮮效果[1]。殼聚糖（CS）作為天然的堿性多糖，具有一定的成膜性、抗菌性能和良好的生物相容性，已被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域[2,3]。殼聚糖是一種氨基多糖，這種分子結(jié)構(gòu)為改性提供了先決條件。單純的殼聚糖抗菌效果一般，而且殼聚糖是一種只能溶于無機(jī)酸和有機(jī)酸的多糖，這極大地限制了其應(yīng)用。因此對殼聚糖進(jìn)行改性對于改善水溶性和提高抗菌性以及對拓寬殼聚糖的應(yīng)用具有重要意義。水楊酸（SA）是小分子酸，滲透性強(qiáng)，具有殺菌防腐的作用，常被當(dāng)作食品保鮮劑和防腐劑使用。研究表明水楊酸具有可降低水果在貯藏期間的呼吸強(qiáng)度、增強(qiáng)保護(hù)酶活性、抑制乙烯合成，抑制真菌活性等特性[4,5]。研究表明在殼聚糖分子結(jié)構(gòu)上引入酚羥基可以增加接枝產(chǎn)物的抗氧化活性。

季鏻鹽（TPPB）作為新一代高效、廣譜、低毒殺菌劑，其P元素與季銨鹽的N元素屬于同族元素，并且與季銨鹽具有相似的分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)，但其耐熱性更好，具有泡沫少、pH值適用范圍廣等優(yōu)異性能[6,7]。有研究表明，季鏻鹽因P元素的電負(fù)性比季銨鹽的N元素大，所以，其對細(xì)菌或真菌的電子吸附能力更強(qiáng)，抑菌效果更好[8,9]。

傳統(tǒng)果蔬保鮮技術(shù)多采用高成本的冷藏保鮮、塑料保鮮膜、毒性大且功能單一的化學(xué)試劑[10]。因此，本文針對上述的問題，以天然高分子殼聚糖為基體材料，通過脫水縮合和酰胺化法將水楊酸和季鏻鹽對殼聚糖進(jìn)行雙重抗菌改性，制備具有高效抗菌效果的涂膜保鮮劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖（CS，脫乙酰度：≥95%，粘度100～200 mPa·s）、(3-羧丙基)三苯基溴化鏻（TPPB）、1-羥基苯并三唑-水合物（HOB t），均采購自上海麥克林生化科技有限公司；水楊酸，美國阿拉丁工業(yè)公司；乙酸，西隴科學(xué)股份有限公司；試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Nicolet iS5型傅里葉變換紅外光譜儀，日本島津公司；Bruker 400M型核磁共振，德國布魯克公司；恒溫加熱磁力攪拌器，杭州大力科教儀器有限公司；梅特勒TGA/DSC 3+型熱重分析儀，瑞士梅特勒公司；Zetasizer Nano ZS90納米粒度及Zeta電位分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；冷凍干燥機(jī)，德國Christ公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 水楊酸改性殼聚糖

將殼聚糖溶于1%乙酸溶液中，濃度為0.75%，攪拌至粘稠狀，然后加入不同摩爾比的水楊酸，經(jīng)55～60 ℃下攪拌1.5 h[11]，然后用截留分子量為3500的透析袋透析2～3 d，最后冷凍干燥得產(chǎn)品（SA-CS）。

1.3.2 季鏻鹽改性殼聚糖

采用酰胺化法制備季鏻鹽-殼聚糖聚合物[12]，將殼聚糖溶于1%乙酸溶液中，充分?jǐn)嚢枋怪耆芙?，濃度?.75%，加入引發(fā)劑HOBt反應(yīng)0.5 h，再加入季鏻鹽，在N2環(huán)境下進(jìn)行，反應(yīng)溫度為80 ℃，反應(yīng)時間為24 h，然后用截留分子量為3500的透析袋透析2～3 d，最后進(jìn)行冷凍干燥即得所需樣品（TPPB-CS）。

1.3.3 水楊酸/季鏻鹽改性殼聚糖

采用酰胺化法制備水楊酸/季鏻鹽-殼聚糖聚合物，首先將0.75 g殼聚糖溶于100 mL 1%乙酸溶液中，加入引發(fā)劑HOBt反應(yīng)0.5 h后加入季鏻鹽，在N2環(huán)境下進(jìn)行，反應(yīng)溫度為80 ℃，反應(yīng)時間22 h，然后加入0.45 g的水楊酸，繼續(xù)反應(yīng)0.5 h，之后用截留分子量為3500的透析袋透析2～3 d，最后進(jìn)行冷凍干燥即得所需樣品（SA-CS-TPPB）。

1.3.4 SA-CS-TPPB水溶性測定

稱取0.01 g左右的干燥樣品溶于10 mL水中，震蕩溶解2 h后離心，所得沉淀經(jīng)冷凍干燥后稱重，計算溶解性。

1.3.5 SA-CS-TPPB取代度測定

采用酸堿滴定法測定取代度，通過測定氨基含量的變化來確定殼聚糖的修飾程度。首先取0.3 g左右的樣品溶解于30 mL 0.1 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液中，加入2～3滴甲基橙-苯胺藍(lán)指示劑，用0.1 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定游離的HCl溶液。另取一份殼聚糖置于105 ℃烘干至恒重，測量殼聚糖的含水量。每個樣品做三個平行。計算：

式中：

C1——標(biāo)準(zhǔn)鹽酸濃度，mol/L；

V1——標(biāo)準(zhǔn)鹽酸體積，L；

C2——標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉濃度，mol/L；

V2——標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉體積，L；

H——?dú)ぞ厶呛浚?。

式中：

T1——?dú)ぞ厶堑陌被浚?；

T0——樣品的氨基含量，%。

1.3.6 結(jié)構(gòu)表征

1.3.6.1 傅里葉紅外光譜（FT-IR）

將樣品與KBr研磨成粉壓片，對產(chǎn)物進(jìn)行紅外光譜的定性表征，E＞10（V），掃描波數(shù)范圍4000～400 cm-1。

1.3.6.2 核磁共振（1H-NMR）

將殼聚糖、水楊酸和季鏻鹽/水楊酸殼聚糖接枝物分別溶于D2O中配成10 mg/mL的溶液，用核磁共振儀掃描得到1H-NMR譜圖。

1.3.6.3 X射線衍射（XRD）

使用Cu-K輻射（40 kV，30 mA），掃描速度為5 /min℃ ，室溫。衍射測量范圍為1 °～90 °，角度分辨率為0.0001 °，時間為30 min，分析材料的晶體結(jié)構(gòu)。

1.3.6.4 熱重分析（TG）

TG-209熱重分析儀，稱取10 mg的試樣，在氮?dú)夥諊拢瑢⒃嚇右?0 ℃/min的升溫速率升至600 ℃，得到熱失重曲線。

1.3.6.5 機(jī)械性能測試

將樣品制成寬×厚×長為10 mm×0.6 mm×30 mm的膜，經(jīng)電子萬能試驗(yàn)機(jī)測試，測試速度為10 mm/min，夾距為15 mm。

1.3.7 抗菌性測定

抑菌圈法：把樣品制備成1 mg/mL的溶液，將滅好菌的6 mm濾紙片放入其中浸泡1 h，然后置于涂好菌懸液的平板上，在37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察并測量在濾紙片周圍會形成菌生長禁止圈（即抑菌圈）。抑菌圈的面積越大，抗菌效果越好，并用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用OriginPro 8.5軟件和MestReNova-3作圖，數(shù)值以平均值±SD表示。當(dāng)獲得的p＜0.05時表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 水溶性

從圖1可以看出，隨著水楊酸比例的增加，聚合物水溶性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在CS:SA為1:0.75時水溶性最高，達(dá)到84.4%，原因可能是殼聚糖接枝少量水楊酸可在一定程度上破壞殼聚糖原有的分子鏈規(guī)整度，使溶解性上升，而水楊酸是小分子物質(zhì)，很容易接枝到殼聚糖上，若接枝過量水楊酸會使水楊酸的羥基與殼聚糖的氨基形成更穩(wěn)定的分子內(nèi)氫鍵，從而使殼聚糖聚合物溶解性下降。因此，選出的殼聚糖:水楊酸的最佳摩爾比為1:0.75。

從圖2可以看出，隨著季鏻鹽量的增加，聚合物水溶性曲線逐漸增加，最后趨于水平，即在CS:TPPB為1:1的時候，聚合物達(dá)到了100%，完全溶解，經(jīng)分析原因可能是加入的季鏻鹽達(dá)到一定量后殼聚糖取代度不再提高，季鏻鹽分子量比水楊酸較大，且不會和殼聚糖的氨基形成分子內(nèi)氫鍵，因此不會像水楊酸接枝殼聚糖一樣溶解性隨著摩爾比的增加而下降，而是達(dá)到最大溶解度后不再變化。選出的殼聚糖:季鏻鹽的最佳摩爾比為1:1。

由圖3可知，在確定殼聚糖和水楊酸的摩爾比后，SA-CS-TPPB聚合物的溶解性和TPPB-CS的溶解性曲線一致，溶解性隨著季鏻鹽含量的增加而增大，在達(dá)到完全溶解前，在CS:TPPB:SA為1:0.3:0.75時溶解性為60.00%，大于TPPB-CS摩爾比為1:0.3的45.00%溶解性，但小于SA-CS摩爾比為1:0.75時的84.40%溶解性，CS:TPPB:SA為1:0.5:0.75溶解性為95.00%，大于TPPB-CS摩爾比為1:0.5的90.00%和SA-CS摩爾比為1:0.75的84.40%溶解性，在CS:TPPB:SA為1:1:0.75時聚合物溶解性已達(dá)到完全溶解。說明水楊酸和季鏻鹽同時改性殼聚糖對殼聚糖溶解性的提高不是簡單的疊加，而是相互作用后呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，水楊酸和季鏻鹽同時接枝改性殼聚糖效果比單個對殼聚糖的改性好；水楊酸和季鏻鹽同時改性殼聚糖最佳摩爾比為CS:TPPB:SA為1:1:0.75。

2.2 取代度和Zeta電位

表1是對優(yōu)化后的殼聚糖衍生物做了一個取代度及Zeta電位比較分析，Zeta電位從高到低分別為：SA-CS-TPPB＞SA-CS＞TPPB-CS。由表可知，聚合物取代度相對較高，Zeta電位也比較高，即對菌的吸附能力更強(qiáng)；SA-CS的取代度比TPPB-CS的取代度高，水楊酸用量比季鏻鹽少，而取代度卻更高，是因?yàn)樗畻钏崾切》肿铀?，分子量比季鏻鹽小，更容易接枝到殼聚糖上。

表1 CS、SA-CS、TPPB-CS及SA-TPPB-CS的取代度及Zeta電位 Table 1 Substitution degree and Zeta potential of CS, SA-CS, TPPB-CS and SA-TPPB-CS

2.3 傅里葉紅外光譜

由圖4可知，四條曲線的吸收峰基本相同，在保留殼聚糖特征吸收峰的同時，也體現(xiàn)了季鏻鹽和水楊酸的特征吸收峰。衍生物光譜上1720～1770 cm-1處沒有觀察到酯類的C=O雙鍵的伸縮震動吸收峰，說明它們的反應(yīng)主要在殼聚糖的氨基上，而非與殼聚糖的羥基發(fā)生副反應(yīng)，以酯基鍵的形式接枝到殼聚糖上。

TPPB-CS譜圖在1528 cm-1出現(xiàn)了苯環(huán)C=C的骨架峰，750 cm-1處出現(xiàn)了苯環(huán)的C-H振動吸收峰，說明季鏻鹽成功改性殼聚糖。

SA-CS譜圖中1570 cm-1和1484 cm-1出現(xiàn)了水楊酸苯環(huán)骨架的特征吸收峰1621 cm-1處出現(xiàn)N-H振動吸收峰，說明水楊酸成功接枝到殼聚糖上。

SA-CS-TPPB譜圖均出現(xiàn)了季鏻鹽和水楊酸的特征吸收峰，分別是1527 cm-1、747 cm-1和1621 cm-1、1486 cm-1、1456 cm-1，說明季鏻鹽和水楊酸成功共同改性了殼聚糖。

2.4 核磁共振

圖5為各樣品的核磁共振氫譜圖，2.7×10-6是CS的H-2特征峰，在3.2～3.5之間屬于殼聚糖在H-3、H-4、H-5和H-6位置的氫吸收峰。對比CS的1H-NMR發(fā)現(xiàn)，在SA-CS、TPPB-CS和SA-CS-TPPB譜圖均有殼聚糖的特征吸收峰；SA-CS在6.82×10-6～7.22×10-6處有明顯的特征吸收峰a1出現(xiàn)，這是水楊酸上不同芳?xì)涞奈辗?，說明水楊酸成功接枝到殼聚糖上；在TPPB-CS譜圖在7.5×10-6～8×10-6之間出現(xiàn)了新的信號峰H-p*，這是在季鏻鹽上的側(cè)鏈基團(tuán)苯環(huán)的特征吸收峰。表明殼聚糖的骨架上引入了季鏻基；而在SA-CS-TPPB譜圖既有水楊酸的特征峰a1，也有季鏻鹽的特征峰b，且吸收峰的位置由于季鏻鹽的電子吸附作用發(fā)生了輕微位移，a2左移，b右移。通過核磁進(jìn)一步說明水楊酸和季鏻鹽都成功接枝到殼聚糖上。

2.5 X射線衍射

由圖6可知，殼聚糖（CS）在2θ=20 °處出現(xiàn)強(qiáng)而窄的衍射峰，在2θ=11 °處出現(xiàn)弱而寬的衍射峰，分別對應(yīng)于晶型II和晶型I。三個殼聚糖衍生物在2θ=20 °處的衍射峰強(qiáng)度顯著降低，并且在2θ=11 °處的衍射峰幾乎消失。這一結(jié)果表明，將水楊酸和季鏻鹽接枝到殼聚糖上可以顯著降低殼聚糖的結(jié)晶性，結(jié)晶性的減弱可能是因?yàn)榻又λ畻钏岷图剧l鹽后的殼聚糖分子上-OH和-NH2間的氫鍵作用力減弱，從而其水溶性提高了[13,14]。從圖中也可以看出來，SA-CS比TPPB-CS兩個特征衍射峰要高一些，即SA-CS的結(jié)晶性比TPPB-CS要高，因此其溶解性低一些，印證了前面溶解性的相關(guān)分析。

2.6 熱重分析

熱重分析（TGA）和導(dǎo)數(shù)熱重分析（DTG）曲線顯示了殼聚糖及其衍生物的失重情況，在加熱過程中殼聚糖及其衍生物都發(fā)生了失重反應(yīng)，圖7中，在所有樣品中觀察到的初始重量損失（低于150 ℃）是由于表面水分和內(nèi)部水的損失。殼聚糖降解溫度在250 ℃左右，最大降解速率值的溫度為300 ℃，用水楊酸和季鏻鹽改性后衍生物的降解溫度均有所下降，最大降解速率溫度分別為237.5 ℃、243 ℃和250 ℃，說明水楊酸和季鏻鹽改性殼聚糖對熱穩(wěn)定性有顯著影響，但并沒有完全破壞材料原有的規(guī)整度。

2.7 機(jī)械性能測試分析

由圖8中可知，改性后的殼聚糖衍生物成膜力學(xué)性能均有不同程度的提高，這是因?yàn)榧剧l鹽和水楊酸的引入在一定程度上破壞了殼聚糖分子的結(jié)晶性和規(guī)整性，影響分子空間結(jié)構(gòu)的排列，使得分子間氫鍵作用力減小。殼聚糖衍生物力學(xué)性能的提高，有助于在果蔬涂膜保鮮形成良好的保鮮膜[15]。

2.8 抑菌效果

由圖9可知，SA-CS、TPPB-CS和SA-CS-TPPB三種聚合物較殼聚糖相比均有很好的抑菌效果，對金黃色葡萄球菌的抑菌效果比大腸桿菌的抑菌效果要好，這可能是因?yàn)榻瘘S色葡萄球菌表面所帶的負(fù)電荷高于大腸桿菌，聚合物對金黃色葡萄球菌的吸附性更強(qiáng)[16]；且金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性菌，大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，從細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)來看，革蘭氏陽性菌具有很厚的結(jié)構(gòu)粗糙的肽聚糖細(xì)胞壁，小分子物質(zhì)擴(kuò)散可輕易在此擴(kuò)散，而革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁比革蘭氏陽性菌的更為復(fù)雜，具有一層外膜可選擇透過物質(zhì)，像篩子一樣，因此，聚合物對金黃色葡萄球菌抑菌性能更佳[17,18]。抑菌性從高到低為：SA-CS-TPPB＞ SA-CS＞TPPB-CS。SA-CS的抗菌性比TPPB-CS要好可能是因?yàn)樗畻钏岷图剧l鹽的抗菌機(jī)理不一樣，季鏻鹽主要是通過電子吸附作用達(dá)到抑菌效果；水楊酸是有機(jī)小分子酸，有很強(qiáng)的滲透性，酚羥基能通過促使微生物的蛋白質(zhì)變性，還可以通過誘導(dǎo)機(jī)制改變植物或微生物相關(guān)酶的活性實(shí)現(xiàn)抑菌[19]，而SA-CS和TPPB-CS都是帶正電荷，對菌均有吸附作用，SA-CS在有吸附作用的基礎(chǔ)上還有水楊酸的抗菌機(jī)理，因此其抑菌效果比季鏻鹽的抑菌效果要好。

3 結(jié)論

本研究以天然高分子殼聚糖為基體材料，通過脫水縮合和酰胺化法將水楊酸和季鏻鹽同時對殼聚糖改性，制備出水楊酸/季鏻鹽殼聚糖衍生物，改性后的殼聚糖衍生物結(jié)晶性和熱穩(wěn)定性有所下降，有效提高了殼聚糖衍生物的水溶性、抗菌性和成膜力學(xué)性能，且季鏻鹽和水楊酸同時改性的殼聚糖衍生物比單個改性的衍生物抑菌效果和機(jī)械性能要好，研究得出：

（1）殼聚糖和季鏻鹽的最佳摩爾比為1:1；殼聚糖和水楊酸的最佳摩爾比為1:0.75；即兩個同時改性的摩爾比為殼聚糖:季鏻鹽:水楊酸為1:1:0.75。

（2）水楊酸改性殼聚糖可有效提高殼聚糖的抗菌性和溶解性，季鏻鹽改性殼聚糖可很好的提高殼聚糖的溶解性和抗菌性，TPPB-CS比SA-CS的溶解性好，而SA-CS的抗菌性比TPPB-CS要好，將水楊酸和季鏻鹽一起改性可將兩者的抗菌優(yōu)勢互補(bǔ)，更好的提高殼聚糖的抗菌性。

綜上，殼聚糖經(jīng)水楊酸和季鏻鹽改性可對殼聚糖的溶解性和抗菌性有協(xié)同增效作用，所得殼聚糖衍生物有很好的水溶性、抗菌性和機(jī)械性能，在果蔬涂膜保鮮方面擁有不錯的應(yīng)用前景。