陳錦輝，漆欣，易陽,2，侯溫甫,2，艾有偉,2，王宏勛,2，閔婷,2*

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢 430023）

（2.湖北省生鮮食品工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430023）

蓮藕是一種富含多種營養(yǎng)物質(zhì)的水生蔬菜，其中淀粉、多糖、酚類等為其主要成分[1,2]。然而蓮藕在采 后貯藏和加工過程中品質(zhì)容易發(fā)生變化，極大的縮短了貯藏時間[3]，主要表現(xiàn)在褐變、硬度、失重、可溶性固形物、可滴定酸、抗壞血酸含量以及腐爛率等品質(zhì)的變化[4]。

溫度是影響果蔬貯藏品質(zhì)的重要因素之一，低溫貯藏能有效地調(diào)節(jié)果蔬的生理活動，降低各種生理生化反應(yīng)速度，延緩果蔬品質(zhì)劣變[5,6]，同時還可抑制微生物的生長繁殖，延長貨架期[7]，周白雪[8]研究發(fā)現(xiàn)4 ℃低溫貯藏能有效延緩蓮藕的褐變，提高了蓮藕貯藏品質(zhì)，且4 ℃低溫貯藏蓮藕中酚類合成相關(guān)基因PAL1/2、4CL1、CHI1、CHS4/5，其中CHI1的表達下調(diào)可能與褐變延緩有關(guān)。3±0.5 ℃貯藏有效地維持龍眼果實的色素和營養(yǎng)品質(zhì)，提高其貯藏性[9]。巴良杰等[10]研究發(fā)現(xiàn)8 ℃低溫貯藏可以較好地維持西番蓮的色澤和營養(yǎng)品質(zhì)，并延緩果實的衰老。然而，低溫貯藏只能短時的延長果蔬等農(nóng)產(chǎn)品的貨架期，并不能滿足產(chǎn)品長時間貯藏的需求，而且低溫貯藏還易導(dǎo)致果蔬發(fā)生冷害脅迫等問題[11]。近年來冰溫貯藏在果蔬、肉類制品、水產(chǎn)品等農(nóng)產(chǎn)品中研究較多，在農(nóng)產(chǎn)品保鮮和長時間貯藏等方面具有很大的潛力[12]。鮮切山藥在冰溫貯藏條件下維持較好的品質(zhì)，延長了貨架期[13]。梁桉婕等[14]研究發(fā)現(xiàn)冰溫-1.5 ℃貯藏延緩了羅非魚中微生物的腐敗，同時也維持了羅非魚的鮮度。近冰溫貯藏還提高了櫻桃的抗氧化性，同時維持了細胞膜的完整性，貯藏時間可長達100 d[15]。

黃利剛等[16]研究表明蓮藕的冰點為-1.7 ℃，與4 ℃低溫貯藏相比，冰溫貯藏抑制了多酚氧化酶的活性，延緩了總酚含量和水分含量的下降，明顯延長了蓮藕的貯藏時間。雖然前人研究了在冰溫貯藏條件下蓮藕的理化特性和生理變化[16]，但對蓮藕質(zhì)構(gòu)、微觀結(jié)構(gòu)的變化和營養(yǎng)品質(zhì)等并未研究，尤其是多酚類化合物。多酚是蓮藕主要的營養(yǎng)物質(zhì)之一，且種類豐富，謝君等[17]報道了蓮藕中的酚類物質(zhì)以表兒茶素、沒食子兒茶素和兒茶酚為主，所以開展冰溫貯藏過程中酚物質(zhì)的變化來評價蓮藕的品質(zhì)具有重要的意義。因此，本論文研究了冰溫貯藏條件下，蓮藕貯藏過程中外觀品質(zhì)、質(zhì)構(gòu)、淀粉微觀結(jié)構(gòu)、總酚、酚酸類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)和非黃酮類物質(zhì)的變化，為蓮藕長時間的貯藏和品質(zhì)的維持提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“鄂蓮5號”蓮藕從武漢市江夏區(qū)棋良公司生產(chǎn)基地現(xiàn)場采收，選取的蓮藕外形相近（直徑在8～10 cm范圍內(nèi)，長度在15～18 cm范圍內(nèi)）、顏色無明顯差異、表面無機械損傷，迅速裝袋運回實驗室，于4 ℃預(yù)冷24 h[18]。

乙醇、福林酚、無水碳酸鈉、沒食子酸，國藥集團化學(xué)試劑有限公司（用于總酚含量沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線）；標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸、兒茶素、沒食子兒茶素、蘆?。ㄓ糜诟咝б合嗌V）等，Sigma公司；甲醇、冰乙酸，色譜純，F(xiàn)isher公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Canon DS12627數(shù)碼相機，佳能；JZ-300通用色差計，深圳市金淮儀器設(shè)備有限公司；Agilent-1260LC高效液相色譜系統(tǒng)，安捷倫科技有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；MSTA.XTplus型質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro System公司；MIR-154型低溫貯藏箱，日本三洋；XHF-D高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司；GL-20G-Ⅱ離心機，上海安亭科學(xué)儀器公司；A360型紫外可見分光光度計，翱藝儀器（上海）有限公司；HH-6恒溫水浴鍋，常州天瑞儀器有限公司；Thermo Scientific Apreo 2掃描電子顯微鏡，OPTON有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗材料處理

用自來水洗凈蓮藕表面的淤泥，并用潔凈鋒利、已消毒的刀具對蓮藕進行斷節(jié)切分，藕節(jié)切口完整且內(nèi)部組織未接觸空氣。將蓮藕隨機分為2組，每組24節(jié)完整的蓮藕，分別放置于-1±0.5 ℃和4±0.5 ℃冰箱中貯藏，每2周進行一次取樣測定指標(biāo)，并進行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3.2 拍照

用數(shù)碼相機拍攝蓮藕整藕和切開后的圖片。

1.3.3 色差的測定

用手持式色差儀測定蓮藕可食用段表皮，選取3個不同的測定點，記錄L*值。

1.3.4 質(zhì)構(gòu)的測定

質(zhì)構(gòu)的檢測方法參考Min等[19]進行。取蓮藕肉切成1 cm×1 cm×1 cm（長×寬×厚）左右的厚塊作為檢測樣品待用。質(zhì)構(gòu)儀測定采用TPA模式，P/45探頭，100 g觸發(fā)力，初始速度10.0 mm/s，下壓速度0.5 mm/s，結(jié)束上行速度10.0 mm/s，兩次壓縮中間停留時間5 s，形變35%。

1.3.5 掃描電子顯微鏡

參考Chen等[20]的方法，將蓮藕切成片狀，用0.1 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖溶液清洗藕樣3次，每次15 min，4%戊二醛于4 ℃固定。0.1 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖溶液清洗藕樣3次，每次15 min。然后采用30%、50%、70%、90%、100%的乙醇梯度洗脫，每次5 min。乙酸異戊酯：丙酮體積比1:1和純乙酸異戊酯各置換兩次，每次5 min，完成后用濾紙擦干樣品表面乙酸異戊酯，用臨界干燥儀進行干燥。將干燥好的樣品固定在樣品臺上，使用離子濺射鍍膜儀（E-1010）將樣品噴碳鍍金，5 min后將樣品臺取出，然后用掃描電子顯微鏡觀察其表面結(jié)構(gòu)，將電子槍加速電壓設(shè)定為15 kV，放大倍數(shù)為500倍。

1.3.6 總酚含量的測定

總酚含量參考Min等[21]的方法進行。將3.0 g凍樣藕肉組織樣品用30 mL 60%乙醇冰浴勻漿6 min，10000 r/min離心10 min后取上清液。樣品組取0.125 mL上清液與0.5 mL蒸餾水混合，對照組取0.625 mL蒸餾水，加入0.125 mL Folin酚試劑。充分混合后室溫下靜置6 min，加1.25 mL 7% Na2CO3和1.0 mL蒸餾水，25 ℃水浴避光靜置90 min，在760 nm波長處測定吸光度。用沒食子酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表示為沒食子酸當(dāng)量/質(zhì)量（mgGAE/kg）。

1.3.7 蓮藕中單體酚含量的測定

蓮藕酚類物質(zhì)提取參考許金蓉[22]方法略作修改：稱取32 g蓮藕樣品，加入160 mL預(yù)冷的pH 3.0 40%乙醇勻漿，超聲72 min；4500 r/min離心10 min，過濾分離上清液；濾渣加入200 mL預(yù)冷的pH 3.0 40%乙醇，超聲10 min，重復(fù)浸提1次，合并上清液。真空旋蒸濃縮，并用甲醇定容至15 mL。

1.3.8 高效液相測定條件

色譜柱：XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；色譜條件：檢測焦性沒食子酸、天麻素、香豆酸、沒食子兒茶素、鄰苯二酚、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、槲皮素、芹菜素的程序為：流動相A為甲醇，B為0.4%冰醋酸，流速為1.0 mL/min，色譜柱溫度30 ℃，紫外檢測器波長為280 nm，進樣體積為20 μL，線性洗脫程序見表1。檢測沒食子酸、蘆丁、金絲桃苷、白藜蘆醇的程序為：流動相A為乙腈，B為0.4%冰醋酸，流速為1.0 mL/min，色譜柱溫度30 ℃，紫外檢測器波長為280 nm，進樣體積為20 μL，線性洗脫程序見表2。混合酚類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

表1 甲醇流動相線性洗脫程序 Table 1 Mobile phase linear elution program

表2 流動相乙腈線性洗脫程序 Table 2 Mobile phase acetonitrile linear elution program

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

每次測定做3個平行，實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS和Origin 2018軟件進行分析與作圖，采用單因素方差分析（ANOVA）和鄧肯氏（Duncan’s）差異分析，*代表具有顯著性差異（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮藕的外觀品質(zhì)、色差和褐變度

-1 ℃冰溫貯藏對蓮藕外觀的影響如圖2a所示，在第8 w時，4 ℃蓮藕表面出現(xiàn)黑色的斑點，切開后蓮藕組織已經(jīng)發(fā)生嚴重的褐變，而-1 ℃貯藏蓮藕表皮略微泛黃，切開的蓮藕組織無明顯的褐變。蓮藕表皮的L*值（圖2b）在整個貯藏期間呈現(xiàn)下降趨勢，-1 ℃貯藏下降了9.56%，4 ℃貯藏下降了12.61%，在貯藏第6 w后，-1 ℃貯藏的蓮藕的白度顯著高于4 ℃貯藏（p＜0.05）。結(jié)果表明-1 ℃低溫貯藏有利于延緩蓮藕的外觀品質(zhì)劣變，且在10 w的貯藏期內(nèi)，-1 ℃貯藏可顯著延緩蓮藕肉質(zhì)部分的褐變。Zhao等[23]的研究也證實了近冰溫貯藏（-1.4 ℃）延緩了油桃外觀品質(zhì)的劣變，抑制了果肉的冷害作用。Liu等[24]冰溫貯藏（-2.5 ℃）桃果實能有效延長貯藏期至60 d。

2.2 蓮藕的質(zhì)構(gòu)

由圖3a～3c可知，在貯藏期間蓮藕硬度、彈性、咀嚼度均呈現(xiàn)下降趨勢，-1 ℃貯藏條件下的硬度下降了33.34%，4 ℃貯藏下降了50.22%，在第4 w后，-1 ℃貯藏的蓮藕硬度顯著高于4 ℃貯藏（p＜0.05）；咀嚼度在整個貯藏期間僅在第10 w有顯著差異（p＜0.05）；在整個貯藏期間，-1 ℃貯藏的彈性從0.14 N下降至0.12 N，而4 ℃貯藏下降至0.09 N，在第4 w后高于4 ℃，且在第6 w和第10 w時有顯著差異（p＜0.05）。結(jié)果表明-1 ℃貯藏能有效延緩蓮藕質(zhì)構(gòu)的下降，提高蓮藕的貯藏性能。冰溫貯藏延緩果實硬度的下降在杏[25]、蘋果[26]、藍莓[27]、獼猴桃[28]等果蔬中也得以證實。

2.3 蓮藕淀粉粒的微觀狀態(tài)

在電子顯微鏡下觀察到蓮藕中淀粉粒的狀態(tài)如圖4所示，在前4 w內(nèi)，兩貯藏溫度下淀粉粒狀態(tài)飽滿光滑具有光澤，細胞壁排列緊密整齊；在第6 w后，4 ℃貯藏蓮藕淀粉粒開始斷裂，表面凹凸不平且發(fā)暗，細胞壁排列較松散，而-1 ℃貯藏的淀粉粒依舊光滑飽滿具有光澤，沒有斷裂的跡象，細胞壁排列整齊。在第10 w時，4 ℃貯藏觀察到的淀粉顆粒干癟，且大部分斷裂成細小的狀態(tài)，-1 ℃貯藏的蓮藕淀粉粒暗淡無光澤，淀粉粒斷裂只有少部分。結(jié)果表明，冰溫貯藏能維持淀粉粒的形態(tài)和光澤，且對細胞壁沒有破壞作用，延緩蓮藕的品質(zhì)劣變。Fan等[29]也通過電子顯微鏡觀察到近冰溫貯藏（-2.1 ℃～-1.7 ℃）杏果實的細胞壁緊實且排列整齊，與本研究結(jié)果相似。

2.4 蓮藕貯藏過程中總酚的變化

總酚含量的變化趨勢如圖5，在貯藏前2 w內(nèi)，總酚含量呈上升趨勢，之后呈下降趨勢。在第4 w后-1 ℃貯藏的蓮藕中總酚含量顯著（p＜0.05）高于4 ℃。在貯藏結(jié)束時，與初始值相比，-1 ℃貯藏含量升高了12.63%，而4 ℃貯藏降低了24.82%。這表明冰溫貯藏比低溫貯藏能更好的維持蓮藕總酚含量，提高蓮藕的抗氧化性。在貯藏后期，果蔬會成熟衰老，小分子物質(zhì)間會發(fā)生轉(zhuǎn)化[30]，蓮藕總酚含量略有上升可能是貯藏過程其它物質(zhì)次生代謝所引起的。Zhao等[31]研究發(fā)現(xiàn)在70 d的長期貯藏時間內(nèi)，冰溫貯藏能保持油桃貯藏后期較高的總酚含量，與我們的研究結(jié)果一致。

2.5 蓮藕貯藏過程中酚酸類物質(zhì)的變化

蓮藕貯藏過程中酚酸類物質(zhì)的含量變化如圖6所示，蓮藕中酚酸類的單酚含量較低，香豆酸（圖6a）含量在前4 w內(nèi)呈下降趨勢，之后有略微的上升，兩貯藏溫度間無顯著差異，總體來看香豆酸含量無明顯變化。沒食子酸含量的變化如圖6b，-1 ℃貯藏呈先下降后上升趨勢，4 ℃貯藏有略微上升的趨勢，在第4 w后，4 ℃貯藏的含量高于-1 ℃。綠原酸的變化如圖6c所示，在整個貯藏期間，-1 ℃貯藏的含量呈下降趨勢，在第2周含量最高為6.14 μg/g，而4 ℃貯藏呈先上升后下降趨勢，在第8 w時出現(xiàn)峰值為9.45 μg/g，且在第4 w后均顯著高于-1 ℃貯藏（p＜0.05）。綠原酸是植物體在有氧呼吸過程中產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物[32]，4 ℃貯藏的蓮藕綠原酸含量升高，可能是進行了有氧呼吸，而冰溫貯藏抑制了蓮藕呼吸或呼吸相關(guān)酶活，從而導(dǎo)致綠原酸含量呈下降趨勢。酚酸類是引起蓮藕褐變的主要物質(zhì)，王清章等[33]研究了蓮藕中多酚氧化酶的最適底物是沒食子酸，本研究中-1 ℃貯藏沒食子酸含量低于4 ℃，這表明冰溫貯藏能抑制蓮藕貯藏期間沒食子酸的合成，從而延緩蓮藕的褐變。

2.6 蓮藕貯藏過程中黃酮類物質(zhì)的變化

冰溫貯藏對蓮藕黃酮類物質(zhì)的影響如圖7所示，黃酮類物質(zhì)是蓮藕酚類的主要成分，含量較高。在貯藏期間，蘆?。▓D7a）的含量呈先上升后下降趨勢，初始含量為3.30 μg/g，在貯藏結(jié)束時-1 ℃貯藏的含量為7.32 μg/g，而4 ℃貯藏的含量為3.12 μg/g，-1 ℃貯藏的含量顯著高于4 ℃（p＜0.05）。蘆丁是一種抗氧化物質(zhì)，在貯藏前期蘆丁含量上升，可能是蓮藕采后誘導(dǎo)了防御機制，促進了蘆丁的合成，抗氧化性有所提高[34]。金絲桃苷（圖7b）的含量變化與蘆丁相似，在貯藏結(jié)束時-1 ℃貯藏的含量為6.10 μg/g，4 ℃貯藏的含量為1.18 μg/g，-1 ℃貯藏的含量顯著高于4 ℃（p＜0.05）。兒茶素（圖7c）的含量呈下降趨勢，-1 ℃貯藏下降了57.90%，4 ℃貯藏下降了31.78%，在第4 w后，-1 ℃貯藏的含量均顯著低于4 ℃（p＜0.05），這表明冰溫貯藏能有效降低蓮藕褐變底物兒茶素的含量，這與漆欣等[35]的研究結(jié)果一致。沒食子兒茶素（圖7D）含量呈下降趨勢，在整個貯藏期間，-1 ℃貯藏的含量均顯著高于4 ℃。在貯藏前期，由于溫度急劇下降至冰溫，誘導(dǎo)了蓮藕的防御機制[36]，促進了沒食子兒茶素前體物質(zhì)的合成，從而導(dǎo)致沒食子兒茶素含量有所升高。黃酮類物質(zhì)生物合成起始于苯丙氨酸解氨酶解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）催化的苯丙氨酸代謝，之后進入4-香豆酸輔酶A連接酶（4-coumarate: CoA lig- ase，4CL）催化的類黃酮代謝途徑，黃烷酮經(jīng)一系列酶催化形成二氫黃酮，二氫黃酮經(jīng)黃酮醇合成酶（flavonol synthase，F(xiàn)LS）催化合成黃酮醇[37]，黃酮類呈下降趨勢，這可能是蓮藕中黃烷醇向黃酮醇轉(zhuǎn)化的結(jié)果。因此，-1 ℃貯藏能有效延緩蓮藕黃酮類物質(zhì)的減少。

2.7 蓮藕貯藏過程中非黃酮類物質(zhì)的變化

冰溫貯藏對蓮藕非黃酮類物質(zhì)的影響如圖8所示，天麻素（圖8a）在蓮藕中含量較高初始值為48.12 μg/g，且呈上升趨勢，-1 ℃貯藏的最高含量為148.51 μg/g，4 ℃貯藏的最高含量為96.65 μg/g，在整個貯藏期間-1 ℃均顯著高于4 ℃（p＜0.05）。焦性沒食子酸（圖8b）的含量呈先下降后上升趨勢，-1 ℃貯藏的最低含量為6.60 μg/g，4 ℃貯藏的最低含量為4.46 μg/g，除第4 w外，-1 ℃貯藏的焦性沒食子酸含量均顯著高于4 ℃（p＜0.05）。鄰苯二酚（圖8c）的含量呈下降趨勢，-1 ℃貯藏的最低含量為2.13 μg/g，4 ℃貯藏的最低含量為2.70 μg/g，兩貯藏溫度下鄰苯二酚的含量差異并不顯著（p＞0.05）。結(jié)果表明，冰溫貯藏能維持蓮藕中天麻素和焦性沒食子酸的含量，延緩了非黃酮類物質(zhì)的減少。

3 結(jié)論

在10 w的貯藏時間內(nèi)，-1 ℃貯藏能較好的維持蓮藕外觀品質(zhì)和較高的果肉硬度，并且細胞壁完整性沒有遭到明顯破壞，從而延長了蓮藕的貯藏時間。同時，-1 ℃貯藏延緩了總酚含量的降低，提高了抗氧化性；降低了酚酸類物質(zhì)的含量，減少了褐變底物的生成；延緩了黃酮類物質(zhì)的減少，維持了非黃酮類物質(zhì)的含量。因此，冰溫貯藏對延長蓮藕貯藏時間和延緩品質(zhì)劣變具有重要意義。