倪澤平，孫堯華，宋賢良,2*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）（2.廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642)

涼果也稱為蜜餞，是我國(guó)傳統(tǒng)特色的休閑食品，其口感清爽、風(fēng)味獨(dú)特、保質(zhì)期長(zhǎng)，廣受消費(fèi)者歡迎。涼果的傳統(tǒng)加工方法是以青梅、杏、佛手等原料經(jīng)鹽 腌或糖漬、干燥、調(diào)味等工藝制成的干型和半干型制品，制作工藝對(duì)生產(chǎn)設(shè)備要求較低，多以傳統(tǒng)手工方式為主[1]，整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中衛(wèi)生管理不嚴(yán)格或未設(shè)有微生物監(jiān)測(cè)程序，加之長(zhǎng)時(shí)間滲糖易導(dǎo)致糖液發(fā)酵，微生物超標(biāo)。其次，涼果浸糖不足，含水量較高或后期貯藏溫度高、潮濕、通風(fēng)不良等也會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌與霉菌超標(biāo)[2]。余元善等[3]對(duì)廣式?jīng)龉善愤M(jìn)行微生物種群調(diào)查，發(fā)現(xiàn)32株芽孢桿菌屬，5株霉菌，包括曲霉屬、毛霉屬、青霉屬。微生物及次級(jí)代謝產(chǎn)物污染不僅給涼果生產(chǎn)加工企業(yè)和消費(fèi)者帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也會(huì)危害人體健康[4]。因此防止涼果在生產(chǎn)、貯藏期間微生物污染是急需解決的問(wèn)題。

目前有關(guān)涼果微生物污染分析及控制的研究已經(jīng)開(kāi)展。陳荷鳳等[5]調(diào)查了果脯蜜餞的細(xì)菌污染情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌污染占總污染菌的92%。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局抽檢，檢出奶油葡萄干的霉菌數(shù)超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的239倍[6]。高慧等[7]認(rèn)為蜜餞生產(chǎn)貯藏中常見(jiàn)的腐敗菌為灰葡萄孢菌和擴(kuò)展青梅。劉小翠等[8]對(duì)市售杏脯進(jìn)行微生物指標(biāo)測(cè)定，結(jié)果顯示放線菌、酵母菌為主要超標(biāo)菌。J.VARGA等[9]研究來(lái)源不同國(guó)家的葡萄干表面的霉菌污染情況，數(shù)據(jù)表明，葡萄干表面的黑曲霉和盛泡曲霉是其主要污染源，且污染量對(duì)食品安全造成了威脅。Martorell等[10]發(fā)現(xiàn)高糖食品中，最主要分離出的是接合酵母菌，此菌屬耐受防腐劑、SO2等，是造成蜜餞霉變的主要菌屬。由于涼果的含糖量在60%～70%，具有較高滲透壓，且水分活度較低，所以一般的細(xì)菌不易存活，但部分芽孢桿菌與霉菌抵抗力強(qiáng)，耐滲透壓，在涼果生產(chǎn)加工及貯藏過(guò)程中極易存在[11]。當(dāng)前對(duì)涼果成品中的腐敗霉菌鑒定研究較少，且未對(duì)涼果在常溫貯藏條件下的優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌進(jìn)行深入探究。對(duì)涼果貯藏中存在優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌進(jìn)行分離鑒定，是為實(shí)現(xiàn)涼果殺菌與安全貯藏的關(guān)鍵步驟。

因此本文以葡萄干、話梅、杏脯為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)其在常溫貯藏四個(gè)月后滋生的腐敗霉菌進(jìn)行分離與純化，通過(guò)回接侵染實(shí)驗(yàn)篩選出優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌，采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察初步鑒定霉菌種類結(jié)合簡(jiǎn)單、高效的分子生物學(xué)方法18S rDNA和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS）序列分析技術(shù)，對(duì)優(yōu)勢(shì)霉菌的核糖體基因ITS區(qū)進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，鑒定出優(yōu)勢(shì)霉菌，以期為涼果霉菌的分離純化鑒定提供可靠的方法，也為選擇后續(xù)殺菌方法、優(yōu)化貯藏條件提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

葡萄干、話梅、杏脯均由廣東康輝集團(tuán)提供；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose，PDA）、孟加拉紅培養(yǎng)基（Rose Bengal Medium，RBM）均購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）引物由廣州微生物研究所合成；真菌基因組DNA抽提試劑盒購(gòu)于深圳子科生物科技公司；其余試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

G/36DWS高壓滅菌鍋，致微儀器有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技儀器有限公司；MW-GZT-SZS2000C101超凈工作臺(tái)，東莞市美維凈化設(shè)備有限公司；SHA-BA水浴恒溫振蕩器，常州澳華儀器有限公司；EM ACE600真空鍍膜儀，德國(guó)徠卡儀器有限公司；S1000-96型梯度PCR儀，美國(guó)伯樂(lè)有限公司；Gel DOC XR+凝膠成像系統(tǒng)；DYY-8C電泳儀，北京六一儀器廠；ST16R臺(tái)式冷凍離心機(jī)，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；Axio Observer A1倒置熒光顯微鏡，卡爾蔡司公司。

1.2 方法

1.2.1 葡萄干、話梅、杏脯貯藏期霉菌的分離純化

常溫儲(chǔ)藏4個(gè)月的葡萄干、話梅、杏脯各25 g，放入盛有225 mL生理鹽水中，180 r/min振蕩30 min，制成10倍系列稀釋樣品菌液。取1 mL稀釋液于90 mm無(wú)菌培養(yǎng)皿，及時(shí)倒入冷卻至47 ℃的PDA、RBM 15～20 mL并與樣品混合均勻，培養(yǎng)基凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，置于28 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，霉菌分離純化實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)三次。待菌落長(zhǎng)出后，觀察菌株形態(tài)，并用接種環(huán)挑取典型的霉菌接種到PDA中做有規(guī)則的劃線，經(jīng)過(guò)多次劃線得到純種單菌株。將純種菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)至長(zhǎng)滿斜面，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌的篩選

將分離出的菌株分別接種至PDA固體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)7 d，用適量無(wú)菌水將孢子洗脫到裝有玻璃珠的250 mL無(wú)菌錐形瓶中，震蕩搖勻，調(diào)節(jié)孢子濃度為106～107CFU/mL。采用10% NaClO對(duì)葡萄干、話梅、杏脯消毒殺菌，晾干后備用[12]。將無(wú)菌的葡萄干、話梅、杏脯分別浸泡不同的孢子懸浮液中1 min，作為處理組，將噴灑無(wú)菌水的葡萄干、話梅、杏脯作為對(duì)照組。回接霉菌后的葡萄干、話梅、杏脯分別置于無(wú)菌密封袋中，室溫保藏，觀察表面發(fā)霉情況，將導(dǎo)致涼果腐敗發(fā)霉速度最快的菌株確定為優(yōu)勢(shì)菌。

1.2.3 優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌的形態(tài)特征觀察

將分離的純種菌株，用無(wú)菌接種環(huán)挑取單個(gè)孢子或菌落，點(diǎn)植培養(yǎng)于PDA培養(yǎng)基，方式為點(diǎn)植于等邊三角形三個(gè)頂點(diǎn)，倒置于28 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察其形態(tài)，包括菌落大小、顏色、氣味、邊緣特征、菌絲生長(zhǎng)狀況等。

1.2.4 優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌的顯微結(jié)構(gòu)觀察

5)綜合而言，斜放四角錐受力更為合理，剛度較大，并且焊接球節(jié)點(diǎn)數(shù)量較少，因此本工程閥廳屋蓋采用斜放四角錐三層網(wǎng)架。

采用載玻片觀察法，在載玻片中央滴加一滴乳酸苯酚溶液，用接種環(huán)挑取菌落邊緣的菌絲，平鋪于載玻片中，蓋上蓋玻片，避免氣泡產(chǎn)生。先用低倍鏡找到菌落位置，在換成高倍鏡觀察霉菌分生孢子、分生孢子梗形態(tài)、橫膈膜數(shù)量等。對(duì)照真菌鑒定手冊(cè)[13]、中國(guó)真菌志[14]、GB 4789.16常見(jiàn)產(chǎn)毒霉菌的形態(tài)學(xué)鑒定等資料，對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌進(jìn)行初步鑒定。

1.2.5 rDNA-ITS序列分析

1.2.5.1 DNA提取

將所得優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，按照真菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)提取菌株

DNA。

1.2.5.2 PCR擴(kuò)增[15]

PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠在90 V條件下電泳1 h，電泳緩沖液為1×TAE，用溴化已錠（Ethidium Bromide，EB）染色，用UV凝膠成像儀觀察。用凝膠回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，送至廣州微生物研究所測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果在NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www. ncbi.nlm.nih.gov）中進(jìn)行 BLAST（Basic Local Alignment）序列相似性對(duì)比，基于ITS序列鄰接法（Neighbor-joining），選取同源性較高菌株的ITS序列，用MEGA 6.06（Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version）軟件構(gòu)建發(fā)育樹(shù)，確定菌株的種屬類別。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄干、話梅、杏脯儲(chǔ)藏中腐敗霉菌的分離

葡萄干、話梅、杏脯常溫儲(chǔ)藏4個(gè)月后，對(duì)其腐敗霉菌進(jìn)行2～3次分離純化，共分離出17株菌株。從葡萄干中分離出5種霉菌14株，分別命名為S1～S5，其中S1分離出7株，S2分離出3株，S3分離出1株，S4分離出1株，S5分離出1株；從話梅中分離出1種霉菌2株，命名H1；從杏脯中分離出1株霉菌，命名為X1。由圖1可知，霉菌S1在PDA中呈灰綠色，蔓延式生長(zhǎng)，菌絲絨毛狀，凸起，有白色菌絲外圈，無(wú)滲透液，反面接近黑色；霉菌S2菌落中心為青色，粉末狀，外圍為灰色菌絲，質(zhì)地緊密，有霉味，菌落中心反面為白色，外圍呈黃色。霉菌S3菌落呈乳白色，絨毛狀，蔓延式生長(zhǎng)，整體平坦，菌落反面呈淡黃色。霉菌S4菌落中心有致密的絨毛狀菌絲，氈狀或絨毛狀，凸起，外圍為黑色菌絲且較為粗糙，生長(zhǎng)迅速，菌落反面呈黑色。霉菌S5菌落中心呈白色，絨狀，整體較為平坦，反面顏色不變，生長(zhǎng)較為緩慢。霉菌H1在PDA中菌落中心呈灰褐色，外圍為灰色菌絲，致密的絨狀，凸起，生長(zhǎng)迅速，菌落背面的顏色加深，霉菌X1菌落呈檸檬黃色，蔓延式生長(zhǎng)，絨毛狀或絮狀，整體向上凸起，外圍為白色菌絲圈，菌落背面顏色不變。

2.2 優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌的篩選

從已經(jīng)發(fā)生霉變的涼果中分離出的7種菌，制成106～107CFU/mL孢子懸浮液，分別回接至無(wú)菌的葡萄干、話梅、杏脯中?；亟覵3、S4、S5的涼果雖然有異味，但表面無(wú)明顯霉變現(xiàn)象。而霉菌S1、S2、X1、H1在回接18～20 d內(nèi)，便導(dǎo)致涼果霉變：葡萄干與對(duì)照組相比表面出現(xiàn)了黃色霉斑，并伴隨一股酸臭味；話梅表面顏色加深，局部返砂，出現(xiàn)深褐色霉斑，霉斑附近有白色菌絲，與常溫貯藏4個(gè)月的話梅霉變現(xiàn)象相同；杏脯發(fā)生了明顯褐變，并有亮黃色的霉斑。由于比涼果常溫貯藏4個(gè)月和回接霉菌S3、S4、S5發(fā)生變質(zhì)的時(shí)間大大縮短了，因此把導(dǎo)致涼果腐敗發(fā)霉速度最快的霉菌S1、S2、X1、H1確定為優(yōu)勢(shì)菌。

2.3 優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌的顯微結(jié)構(gòu)

霉菌S1、S2、H1、X1的顯微鏡下的形態(tài)如圖3。S1的分生孢子呈圓形或橢圓，分生孢子梗直立單生或簇生，少有分支，無(wú)分隔。S2分生孢子呈球形壁光滑，分生孢子梗頂端帚狀，有一串孢子。H1菌絲多有分隔，分生孢子呈橢圓或卵形，具有明顯的喙或尖端有明顯的凸起，孢子有橫、縱或斜的真隔膜，表面光滑，分生孢子梗短粗，多分生或簇生。X1的分生孢子梗有指狀分支，似帚狀，有隔膜，小梗頂部的分生孢子頭呈橢圓或圓狀。

2.4 優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌的rDNA-ITS序列分析

選擇真菌通用引物ITS/ITS4對(duì)4株優(yōu)勢(shì)霉菌的rDNA-ITS進(jìn)行特異性擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4，其中泳道M：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量為DL1000，霉菌S1、S2、H1、X1的ITS序列分別為462、439、478、492 bp。將優(yōu)勢(shì)霉菌的PCR擴(kuò)增序列在NCBI中Genbank中已知的菌株進(jìn)行相似性對(duì)比，選取同源性較高的菌株，將其ITS全序列用MEGA 6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

圖5表明霉菌S1與芽枝狀枝孢霉（Cladosporium velox）ITS序列在同一分支，表明他們的親緣關(guān)系相近，同源性為100%，結(jié)合對(duì)霉菌S1的形態(tài)特征觀察、ITS序列的相似性及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果，鑒定霉菌S1為芽枝狀枝孢霉。霉菌S2與檸檬黃青霉（Penicillium citreosulfuratum）、暗黃青霉（Penicillium citreonigrum）、毒青霉（Penicillium toxicarium）等親緣關(guān)系相近，同源性均達(dá)99.77%，結(jié)合對(duì)霉菌S2的形態(tài)特征觀察、ITS序列的相似性及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果，鑒定霉菌S2為暗黃青霉。霉菌H1與六出花鏈格孢（Alternaria alstroemeriae）、巴恩斯鏈格孢（Alternaria burnsii）、細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuissima）等親緣關(guān)系相近，同源性均達(dá)100%，結(jié)合對(duì)霉菌H1的形態(tài)特征觀察、ITS序列的相似性及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果，鑒定霉菌H1為細(xì)極鏈格孢。霉菌X1與菌核青霉（Penicillium sclerotiorum）親緣關(guān)系相近，同源性均達(dá)100%，結(jié)合對(duì)霉菌X1的形態(tài)特征觀察、ITS序列的相似性及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果，鑒定霉菌X1為菌核青霉。

涼果在貯藏與銷售過(guò)程中，因操作不規(guī)范、衛(wèi)生狀況不達(dá)標(biāo)等原因，極易導(dǎo)致涼果霉變。霉菌污染不僅降低產(chǎn)品品質(zhì)，而且產(chǎn)生的毒素及次級(jí)代謝物還會(huì)危害人體健康。對(duì)涼果常溫貯藏中的優(yōu)勢(shì)霉菌進(jìn)行分離鑒定，是針對(duì)性選擇后續(xù)殺菌保鮮工藝及參數(shù)的重要基礎(chǔ)。目前優(yōu)勢(shì)霉菌的篩選方法不統(tǒng)一。李維蛟等[16]從三七中藥材分離出的霉菌數(shù)量占優(yōu)勢(shì)的菌株視為優(yōu)勢(shì)菌。鄭云華[17]將在整個(gè)茶渥堆發(fā)酵過(guò)程中一直存在的青霉與曲霉作為優(yōu)勢(shì)菌。岳曉禹等[18]以肉眼可見(jiàn)占生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的霉菌作為玉米貯藏過(guò)程中優(yōu)勢(shì)霉菌。牛佳佳等[19]將分離純化后的霉菌回接，驗(yàn)證霉菌致腐能力，以確定腐敗霉菌。本實(shí)驗(yàn)也采用回接浸染試驗(yàn)，將分離純化后的5株霉菌回接葡萄干表面、1株霉菌回接話梅表面、1株霉菌回接杏脯表面，通過(guò)涼果霉變時(shí)間長(zhǎng)短來(lái)分別確定葡萄干、話梅、杏脯中的優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌，極大提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。傳統(tǒng)的霉菌鑒定主要依據(jù)霉菌在培養(yǎng)基的形態(tài)、顯微鏡下的結(jié)構(gòu)與生理生化指標(biāo)鑒別。生理生化不僅操作繁瑣，而且不能對(duì)霉菌進(jìn)行精準(zhǔn)的鑒定[20,21]。本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)的形態(tài)觀察和顯微結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，結(jié)合簡(jiǎn)單高效的rDNA-ITS序列分析法，提高霉菌鑒定的可靠性[22,23]。

青霉屬、曲霉屬、鏈格孢屬均屬于常見(jiàn)的食品腐敗霉菌。Gündüz等[24]、Cetinkaya等[25]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)葡萄干表面優(yōu)勢(shì)霉菌主要為曲霉屬、貝氏菌屬、散囊菌屬和青霉屬，杏脯的霉菌主要為曲霉、鏈格孢、青霉。劉彬[26]、陳存坤等[27]、吳思雅等[28]、袁乙平[29]從葡萄干中主要分離出了曲霉及其赭曲霉毒素，從杏脯、話梅的原料即采后的杏和青梅中發(fā)現(xiàn)，青霉屬和鏈格孢屬同樣是優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌。本實(shí)驗(yàn)從葡萄干、話梅、杏脯致腐霉菌中分離出了枝孢屬霉菌、鏈格孢霉菌、青霉菌，研究結(jié)果與其他研究者的結(jié)論存在差異，推測(cè)可能是地域、加工條件等影響。

3 結(jié)論

對(duì)葡萄干、話梅、杏脯在常溫貯藏過(guò)程中生長(zhǎng)的霉菌進(jìn)行分離純化，通過(guò)傳統(tǒng)的培養(yǎng)基中真菌形態(tài)特征、顯微鏡觀察結(jié)合PCR擴(kuò)增測(cè)序分子生物學(xué)法對(duì)引起葡萄干、話梅、杏脯腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢(shì)霉菌鑒定，確定葡萄干的優(yōu)勢(shì)霉菌為芽枝狀枝孢霉和暗黃青霉，話梅的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為細(xì)極鏈格孢，杏脯的優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌為菌核青霉，為今后防止涼果在生產(chǎn)加工及銷售貯藏中腐敗變質(zhì)，選擇適宜的殺菌保鮮方式提供了參考依據(jù)。