徐淑琴，馬祥兆，陳曉慧，賀曦，賀曉龍，冶貴生*

（1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系，青海西寧 810016）

（2.青海省動物疾病病原診斷與綠色防控技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧 810016）

纖維素作為光合作用的主要產(chǎn)物，是地球上含量最豐富、分布最廣泛、永不枯竭的可再生資源[1]。纖維素因分子結(jié)構(gòu)特殊，通常的酶分子和化學(xué)試劑難以與纖維素表面致密結(jié)構(gòu)結(jié)合，對其進(jìn)行破壞分解[2]，這造成了纖維素利用率低下。纖維素的開發(fā)與利用幾乎都是通過生物降解法完成的[3]，該方式具有環(huán)保、高效、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)[4]。真菌、細(xì)菌和放線菌是主要產(chǎn)生纖維素酶的微生物[5]。纖維素降解菌具有培養(yǎng)簡單、發(fā)酵周期短、生長速度快、耐高溫等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域，如微生態(tài)添加劑、秸稈還田和重金屬污染修復(fù)等[6,7]。

纖維素降解菌類中的芽孢桿菌產(chǎn)酶豐富，酶活性相對其他菌株較高，能產(chǎn)生大量的纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶等，提高原料的利用率[8]。芽孢桿菌可形成休眠芽孢，具有抗逆能力強(qiáng)、抑菌譜廣、代謝產(chǎn)物豐厚、培養(yǎng)周期短等特點(diǎn)，目前對該菌屬報道較多的有枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌。芽孢桿菌在發(fā)酵、生防、微生態(tài)制劑等方面有重大的研究意義和應(yīng)用前景[9]。徐同偉等[10]從煙草病株根際土壤中篩選出的沙福芽孢桿菌可有效控制煙草黑脛病危害和提高煙草產(chǎn)量；Rong等[11]從桂花中分離出沙福芽孢桿菌具有抗真菌活性，是一種防治稻瘟病的生物農(nóng)藥；李慶榮等[12]從蠶沙中分離出沙福芽孢桿菌有溶磷解鉀作用可改良土壤，提高土壤肥力；da Fonseca等[13]從石油中分離出負(fù)責(zé)降解芳香族化合物和石油芳烴餾分的沙福芽孢桿菌。沙福芽孢桿菌已在農(nóng)業(yè)、生物防治、石油化工等方面被深入研究并得到了廣泛應(yīng)用。

藏羊生活在海拔高、低溫、低氧的青藏高原，對嚴(yán)酷的自然環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)能力和耐粗飼料的特點(diǎn)，使得藏羊消化道微生物具有較高的生物學(xué)研究價值[14]。本實(shí)驗(yàn)從青海健康藏羊瘤胃液中分離、篩選出纖維素降解菌，利用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性和16S rDNA分子鑒定等方法鑒定分離菌株的種類及系統(tǒng)分類地位，并對分離菌株的生長特性、抑菌能力和藥物敏感性等生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以期為纖維素酶制劑的開發(fā)和藏羊可持續(xù)發(fā)展提供潛在候選菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品及菌株

藏羊瘤胃液采集于青海省海北藏族自治州某養(yǎng)殖場。大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌分離菌株，均由青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院青藏高原動物疾病研究室保存。

1.1.2 試劑

纖維素剛果紅培養(yǎng)基、細(xì)菌生化鑒定管、MH瓊脂（MHA）、胰蛋白胨大豆肉湯，均購于青島海博生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片購于杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T100? ThermalCycler PCR儀，美國BIO-RAD公司；LRH生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；AC2-4S1生物安全柜，新加坡藝思高科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 纖維素降解菌的分離篩選及形態(tài)學(xué)觀察

用胰蛋白胨大豆肉湯對采集的瘤胃液進(jìn)行增菌培養(yǎng)。蘸取增菌液劃線于纖維素剛果紅培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。挑選粉紅色單菌落分離純化后觀察菌落生長情況，并用革蘭氏染色法制片觀察菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)[15]。

1.3.2 分離菌株的生理生化鑒定

選取革蘭氏陽性、有芽孢的桿狀菌株進(jìn)行生理生化鑒定，具體方法參照《伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》（中文第8版）[16]，挑取純化后的單個菌落接種于生化鑒定管，在37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

1.3.3 分離菌株的16S rDNA鑒定

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌株基因組，用細(xì)菌的通用引物對分離株進(jìn)行16S rDNA[17]片段擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測后進(jìn)行測序。將得到的測序序列提交至NCBI中進(jìn)行Blast比對，選取相關(guān)近緣菌株序列用MEGA 7.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法聚類構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[18]。

1.3.4 生長曲線的測定

將分離菌株菌液濃度調(diào)整為0.5個麥?zhǔn)勘葷岫龋臃NLB液體培養(yǎng)基，180 r/min 37 ℃恒溫培養(yǎng)26 h，每2 h測定其在600 nm處吸光度值[19]，記錄數(shù)據(jù)并繪制生長曲線。

1.3.5 抑菌實(shí)驗(yàn)

將致病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌（1×108CFU/mL）涂布于營養(yǎng)瓊脂上，放置四聯(lián)式牛津杯，將培養(yǎng)的分離菌株菌液接入牛津杯中，培養(yǎng)皿4 ℃下放置12 h后，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，測量抑菌圈直徑[20]。

1.3.6 藥物敏感性試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauer法）[21]檢測分離菌株對30種抗生素的敏感程度，將分離菌株菌液濃度調(diào)整為0.5個麥?zhǔn)勘葷幔坎加贛H平板表面，將藥敏片貼于平板表面，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18 h～24 h，記錄抑菌圈的直徑。依據(jù)國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會（National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定結(jié)果。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Excel整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)并處理繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素降解菌的分離篩選及形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

纖維素剛果紅培養(yǎng)基篩選結(jié)果如圖1a，分離菌株的菌落呈圓形、表面光滑、邊緣整齊，培養(yǎng)初期為粉紅色小菌落，后期中間乳白略帶粉色邊緣有透明圈。在光學(xué)顯微鏡下觀察到菌體為單個直桿狀、兩端鈍圓、有芽孢，革蘭氏染色結(jié)果如圖1b，分離菌株呈陽性，將其命名為BS1-ql。研究表明食草反芻動物消化道內(nèi)共生的細(xì)菌、真菌等微生物能夠分泌纖維素酶，可幫助分解纖維素為動物提供能量[22]。本研究以纖維素為單一碳源的剛果紅培養(yǎng)基篩選纖維素降解菌，通過觀察長出菌落顏色及形態(tài)特點(diǎn)判定該菌株是否能降解纖維素，操作簡單便捷，結(jié)果可靠高效。但難以判斷產(chǎn)酶水平的高低，需要通過酶活測定法精確測定菌株產(chǎn)酶水平的高低[23]。

2.1.1 分離菌株的生理生化鑒定

生理生化試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌株BS1-ql能夠利用甘露醇、水楊苷、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖作為單一碳源，不能利用西蒙氏枸櫞酸鹽和丙酸鹽，且不能還原硝酸鹽；過氧化氫酶和氧化酶檢測呈陽性（表1）；生長pH值在5.7，能耐受7% NaCl環(huán)境，不能水解淀粉。生理生化結(jié)果符合芽孢桿菌的特征，且通過對菌株形態(tài)特征的觀察，并對照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》，初步將菌株BS1-ql鑒定為芽孢桿菌屬。

表1 生理生化鑒定試驗(yàn)結(jié)果 Table 1 Biochemical identification results

2.1.2 分子鑒定結(jié)果

PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2顯示，分離菌株所在泳道出現(xiàn)長度在1400 bp左右的目的條帶，測序序列顯示其長度為1422 bp，同源比對結(jié)果表明分離菌株與參考芽孢桿菌菌株同源性均在87%以上、與沙福芽孢桿菌同源性高達(dá)100%且處于進(jìn)化樹同一分支上，如圖3，親緣關(guān)系最近。結(jié)合菌株形態(tài)特點(diǎn)與生理特征，鑒定分離菌株是沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis）。

傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法操作繁瑣、試驗(yàn)周期長且存在主觀判斷。生理生化鑒定通過測定pH變化和底物利用，可驗(yàn)證細(xì)菌間新陳代謝的方式、產(chǎn)物的不同，再利用被稱為細(xì)菌鑒定“金標(biāo)準(zhǔn)”的16S rDNA基因檢測技術(shù)就可以實(shí)現(xiàn)對微生物快速、微量、精確地鑒定分析[24]。耿曉杰等[25]研究采用16S rDNA基因測序和序列比對分析從青稞小曲中分離到5種芽孢桿菌。Shafi等[26]使用不同的鑒定方法，包括傳統(tǒng)的、生物化學(xué)的和分子方法精準(zhǔn)的鑒定分離出湖水內(nèi)的16株細(xì)菌。本試驗(yàn)與上述研究相同，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)及16S rDNA分子鑒定相結(jié)合，短時間內(nèi)可明確分離菌株為沙福芽孢桿菌。分離篩選的藏羊源沙福芽孢桿菌BS1-ql V-P試驗(yàn)為陰性，與大黑山土壤中[27]分離的沙福芽孢桿菌不同；與中華鱉腸道中[28]分離的2株沙福芽孢桿菌的硝酸鹽還原、甲基紅、淀粉水解試驗(yàn)結(jié)果不一致，可能是由于不同來源或同一來源的菌株之間生化特性會有所差異。

2.2 生長曲線的測定

分離菌株BS1-ql的生長曲線如圖4所示，沙福芽孢桿菌生長速度較快，0 h～2 h為遲緩期，2 h后細(xì)菌開始快速繁殖進(jìn)入對數(shù)生長期，14 h～18 h菌體量趨于穩(wěn)定，到18 h～22 h內(nèi)菌體量又迅速增加，22 h后生長速率逐漸降低進(jìn)入到平穩(wěn)期。

2.3 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分離菌株BS1-ql對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株的抑菌圈直徑分別為8.96、10.34、13.74、14.90 nm，結(jié)果表明沙福芽孢桿菌BS1-ql對這4種致病菌有一定抑制能力，對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制能力最強(qiáng)。芽孢桿菌主要通過競爭、拮抗和誘導(dǎo)這三種作用方式對病原菌產(chǎn)生顯著的抑制效果[29]。Abdelli等[30]通過研究沙福芽孢桿菌的表面活性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)該菌對表皮葡萄球菌等致病菌有抑制能力和抗腫瘤活性。Ngalimat等[31]報道沙福芽孢桿菌對藤黃微球菌有一定的抑制能力。與之相似，本試驗(yàn)分離的沙福芽孢桿菌BS1-ql對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌均有明顯的抑制效果，良好的抑菌活性是沙福芽孢桿菌作為候選益生菌株的重要特征。

2.4 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明（表2），沙福芽孢桿菌分離菌株BS1-ql對絕大多數(shù)抗生素表現(xiàn)出敏感，包括青霉素類的青霉素、氨芐西林和羧芐西林等，氨基糖苷類的新霉素、慶大霉素和卡那霉素等，四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類；對多肽類的多粘菌素B和萬古霉素及頭孢類的頭孢呋辛中度敏感；而對頭孢他啶表現(xiàn)出耐藥性。與宋夢思等[32]所報道蝦腸道中的沙福芽孢桿菌對頭孢噻肟、青霉素、桿菌肽、奧格門汀4種抗生素耐藥不同，此次試驗(yàn)分離得到的沙福芽孢桿菌BS1-ql僅對頭孢他啶表現(xiàn)為耐藥；對其它29種常用抗生素皆表現(xiàn)為不同程度的敏感，說明在藏羊養(yǎng)殖過程中使用的抗生素較少，分離菌株可能含有的耐藥基因較少，這降低了抗生素抗性基因傳播的風(fēng)險，減少了對環(huán)境及人類健康的威脅。

表2 貝萊斯芽孢桿菌分離株對不同藥物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果 Table 2 The susceptibility test results of Bacillus velez isolates to different drugs

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從青海藏羊瘤胃中分離篩選到了1株能降解纖維素的細(xì)菌，菌落呈圓形、表面光滑、邊緣整齊，革蘭氏染色呈陽性，菌體為單個直桿狀、兩端鈍圓、有芽孢，能夠利用甘露醇等，結(jié)合16S rDNA基因分子鑒定結(jié)果，最終確定其為沙福芽孢桿菌。該藏羊源沙福芽孢桿菌生物學(xué)特性良好；生長周期短，培養(yǎng)2 h后進(jìn)入對數(shù)生長期；抑菌能力強(qiáng)，對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌圈均在8.96 mm以上；對青霉素、頭孢氨芐、諾氟沙星等大多數(shù)常見抗生素敏感，僅對頭孢他啶抗生素耐藥。因此具有潛在的益生價值，這能為該菌藏羊源微生態(tài)制劑的研發(fā)提供重要基礎(chǔ)。