謝金莉，杜麗晶，王超躍，王樂琪，葉春婷*，嚴(yán)詩楷，肖雪，李莎莎

（1.廣州創(chuàng)爾生物技術(shù)股份有限公司，廣東廣州 510663）（2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006）（3.上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240）（4.廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院，廣東廣州 510006）

膠原蛋白是動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)，約占動(dòng)物體機(jī)體總蛋白含量的30%[1]，它是所有結(jié)締組織（即皮膚、骨骼、韌帶、肌腱和軟骨）和實(shí)質(zhì)器官的間質(zhì)組織的細(xì)胞外基質(zhì)的主要蛋白之一，為組織提供機(jī)械強(qiáng)度和生理功能[2]。目前，膠原蛋白主要分類有28種，其中I型膠原蛋白在哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)的含量最高，約占膠原總量的70%[3,4]。非變性I型膠原蛋白（non-denatured type-I collagen，NDC-I）是保留有獨(dú)特的三螺旋結(jié)構(gòu)的膠原蛋白，由3條肽鏈組成，每條肽鏈約含1050個(gè)氨基酸殘基，其中三螺旋區(qū)由(Gly-x-y)n重復(fù)序列組成，x常為脯氨酸，y常為羥脯氨酸或羥賴氨酸[5]。NDC-I多采用酸-酶結(jié)合法進(jìn)行提取，來源主要有牛、豬和魚等[6-8]。不同物種來源的NDC-I三螺旋區(qū)的氨基酸序列具有較高的同源性，非螺旋部分有所差異[9,10]。目前，NDC-I多應(yīng)用于醫(yī)療和化妝品領(lǐng)域，具有止血、修復(fù)、保濕、促進(jìn)細(xì)胞黏附和增殖等功效[11-13]。

免疫能力低下是一種由于免疫系統(tǒng)遭到攻擊和破壞，機(jī)體出現(xiàn)的暫時(shí)性或永久性免疫功能障礙的狀態(tài)，極大地危害人類身體健康。因此，通過一些有效的預(yù)防或治療措施，提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，是目前相關(guān)科研人員和醫(yī)務(wù)工作者面臨的重大課題。研究發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫活性[14,15]、促進(jìn)傷口愈合[16]、改善關(guān)節(jié)炎[17]、緩解骨質(zhì)疏松[18]等。其中NDC-I作為膠原蛋白的重要類型之一，對(duì)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)具有一定的作用，但是關(guān)于NDC-I對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)控作用缺乏系統(tǒng)研究，且相關(guān)報(bào)道較少。

環(huán)磷酰胺是臨床上常用的一種化療藥物，用于抑制腫瘤細(xì)胞的生長。但其對(duì)正常細(xì)胞有一些毒副作用，能通過殺傷免疫細(xì)胞從而影響免疫的各個(gè)階段。因此，在免疫毒理學(xué)的研究中，環(huán)磷酰胺被廣泛應(yīng)用于制備動(dòng)物免疫抑制模型[19,20]。本實(shí)驗(yàn)采用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫低下大鼠模型，通過多個(gè)免疫學(xué)指標(biāo)評(píng)估NDC-I對(duì)大鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用，探究其增強(qiáng)免疫力的作用。為今后NDC-I的免疫活性研究提供參考，對(duì)充分利用膠原蛋白開發(fā)相關(guān)保健食品或功能性食品具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量180～200 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)：SYXK（粵）2017-0125，許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0002。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于SPF級(jí)屏障環(huán)境動(dòng)物房飼養(yǎng)，溫度：20～25 ℃，濕度：50%～70%。

1.1.2 藥品與試劑

脾氨肽口服凍干粉（Spleen Aminopeptide Oral Lyophilized Powder，SA），購于大連百利天華制藥有限公司。注射用環(huán)磷酰胺，購于Baxter Oncology GmbH。異氟烷，購于瑞沃德生命科技有限公司。生理鹽水購于廣東科倫藥業(yè)有限公司。免疫球蛋白A（Immunoglobulin A，IgA）、免疫球蛋白 G（Immunoglobulin G，IgG）、白介素-2（Interleukin-2，IL-2）、白介素-4（Interleukin-4，IL-4）、白介素-10（Interleukin-10，IL-10）、干擾素-γ（Interferon-gamma，IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）和乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）含量測定試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。NDC-I（平均分子量300 ku，純度≥90%）從牛筋腱中提取制備，具有完整三股螺旋結(jié)構(gòu)，由廣州創(chuàng)爾生物技術(shù)股份有限公司提供。

1.1.3 儀器與設(shè)備

ZCS電子天平，東莞市怡雪電子有限公司；SC3610型低速離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；RT-6100型酶標(biāo)分析儀，美國伯騰儀器有限公司；R620IP型麻醉機(jī)，瑞沃德生命科技有限公司；Sysmex XN-1000V[BI]全自動(dòng)血液分析儀，日本希森美康公司。

1.2 方法

1.2.1 給藥方法和免疫低下造模的構(gòu)建

SPF級(jí)大鼠36只，實(shí)驗(yàn)環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，每組9只，分別為：NDC-I組[灌胃10.0 mg/(kg·d)非變性大分子膠原]、SA組[陽性對(duì)照組，灌胃0.42 mg/(kg·d)脾氨肽，人用量等效劑量6.3倍]、MC組（模型對(duì)照組，灌胃等體積蒸餾水）、NC組（正常對(duì)照組，灌胃等體積蒸餾水）。連續(xù)灌胃30 d，每天1次。

在實(shí)驗(yàn)的第24天和第25天，除NC組，給予等量生理鹽水腹腔注射外，其它各組給予環(huán)磷酰胺[40 mg/(kg·d)]腹腔注射，共2次。實(shí)驗(yàn)第30天取材，進(jìn)行指標(biāo)檢測。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲水?dāng)z食。

1.2.2 白細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類和血清中免疫活性物質(zhì)測定

異氟烷麻醉后，SD大鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，EDTA管收集血液，使用血細(xì)胞分析儀檢測白細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類。促凝管收集血液，靜置2 h后，3000 r/min離心10 min，取上清液測定血清中IgA、IgG、IL-2、IL-4、IL-10、γ-IFN、TNF-α含量，具體操作按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 胸腺和脾臟指數(shù)、LDH活性和組織形態(tài)觀察

大鼠處理前稱體質(zhì)量，解剖后取脾臟和胸腺，迅速用PBS緩沖液多次漂洗干凈，濾紙吸干，分別稱臟器質(zhì)量。臟器指數(shù)為臟器質(zhì)量與大鼠體質(zhì)量的比值[21]。稱取200 mg組織，勻漿后取上清，按照ELISA試劑盒說明書方法進(jìn)行LDH活性檢測。剩余脾臟和胸腺組織切塊，置于4%多聚甲醛溶液常溫固定后進(jìn)行石蠟包埋、切片和蘇木精-伊紅染色，鏡下觀察組織病理變化。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)資料采用±s表示；兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用ANOVA方差分析，p＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p＜0.01表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 NDC-I對(duì)體重和免疫器官指數(shù)的影響

脾臟和胸腺是機(jī)體重要的免疫器官。胸腺是T淋巴細(xì)胞分化和成熟的中樞免疫器官，可接受抗原刺激，產(chǎn)生免疫應(yīng)答。脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，含有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心。當(dāng)機(jī)體接受抗原刺激后，T淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞數(shù)目增多，相應(yīng)細(xì)胞區(qū)體積擴(kuò)大，免疫器官的體積和重量也隨之增大[22-24]。由表1和表2可知，NDC-I干預(yù)前（實(shí)驗(yàn)第0天）至造模前（實(shí)驗(yàn)第24天）各組之間體重?zé)o顯著性差異（p＞0.05）。腹腔注射環(huán)磷酰胺后（實(shí)驗(yàn)第30 d），模型組體重顯著降低（p＜0.05），并且胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)也顯著下降（p＜0.01）；與模型組比較，陽性對(duì)照組和NDC-I組大鼠的體重?zé)o顯著差異，陽性對(duì)照組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)略有升高，差異不顯著（p＞0.05），NDC-I組胸腺指數(shù)上升（p＜0.05），脾臟指數(shù)具有升高趨勢（p＞0.05）。結(jié)果表明，經(jīng)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫低下模型大鼠體重、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著降低，NDC-I對(duì)大鼠胸腺損傷具有一定的修護(hù)作用。

表1 NDC-I對(duì)免疫低下大鼠體重變化的影響（ˉx±s，n=9） Table 1 Effect of NDC-I on weight change of immunocompromised rats

表2 NDC-I對(duì)大鼠免疫器官指數(shù)的影響（ˉx±s，n=9） Table 2 Effects of NDC-I on immune organic index of rats

2.2 NDC-I對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類的影響

白細(xì)胞計(jì)數(shù)也可以在一定程度上反映機(jī)體非特異性免疫水平。腹腔注射環(huán)磷酰胺后，模型組白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、單核細(xì)胞絕對(duì)值、嗜酸粒細(xì)胞絕對(duì)值、嗜酸粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)、嗜堿粒細(xì)胞絕對(duì)值和嗜堿粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著下降（p＜0.01），中性粒細(xì)胞絕對(duì)值和單核細(xì)胞百分?jǐn)?shù)下降（p＜0.05），說明環(huán)磷酰胺破壞了免疫系統(tǒng)，引起了機(jī)體免疫功能低下。與模型組比較，NDC-I組在預(yù)防性干預(yù)后白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著上升（p＜0.01），且效果優(yōu)于陽性對(duì)照組。

表3 NDC-I對(duì)大鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類的影響（xˉ±s，n=9，109/L） Table 3 Effects of NDC-I on white blood cell count and classification of rats

2.3 NDC-I對(duì)血清中免疫活性物質(zhì)的影響

血清中的免疫球蛋白的含量和輔助性T細(xì)胞（Th細(xì)胞）分泌的細(xì)胞因子水平可以反映機(jī)體的體液免疫功能狀態(tài)[25,26]，因此在本次實(shí)驗(yàn)中，選取血清中的IgA、IgG、IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ等7種免疫活性物質(zhì)，作為反映機(jī)體免疫狀態(tài)的指標(biāo)。

IgG是人血清中含量最豐富的蛋白質(zhì)之一，是體液免疫的主要抗體，約占血清免疫球蛋白總量的80%；而IgA源于腸系膜淋巴組織中的漿細(xì)胞，它主要進(jìn)行局部免疫，其含量僅次于IgG，約占血清免疫球蛋白總量的10～20%[27]。模型組IgA、IgG的含量顯著低于對(duì)照組（p＜0.01）；經(jīng)過NDC-I預(yù)防性干預(yù)后，NDC-I組IgA、IgG的含量接近對(duì)照組且顯著高于模型組（p＜0.01），效果優(yōu)于陽性對(duì)照組（圖1a、圖1b）。本研究中，模型組大鼠血清IgA、IgG含量降低，并在NDC-I預(yù)防性干預(yù)后得到恢復(fù)。提示NDC-I可能通過恢復(fù)IgA、IgG含量來增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫。

眾所周知，環(huán)磷酰胺是一種使用廣泛的細(xì)胞毒性藥物，普遍應(yīng)用于腫瘤的治療中，可對(duì)骨髓的功能產(chǎn)生抑制作用，通過抑制免疫器官的功能并造成體重下降，使白細(xì)胞數(shù)量降低，其代謝產(chǎn)物通過交聯(lián)作用使DNA和蛋白質(zhì)烷基化，從而產(chǎn)生免疫功能的抑制[28,29]。Th細(xì)胞是重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞因子和功能的不同，分為Th0、Th1、Th2和Th3亞群，而Th1和Th2細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子決定了免疫系統(tǒng)的功能。其中，Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ等Ⅰ類細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫應(yīng)答[30,31]，IFN-γ是特異性免疫的調(diào)節(jié)劑，能誘導(dǎo)Th0型細(xì)胞分化成Th1型細(xì)胞，并且能激活巨噬細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和清除胞內(nèi)病原體[32]。而Th2細(xì)胞主要分泌IL-4，IL-10等Ⅱ類細(xì)胞因子，在介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答方面發(fā)揮著重要作用[33]。同時(shí)，TNF-α作為主要的免疫調(diào)節(jié)因子，不僅能夠啟動(dòng)免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)免疫細(xì)胞的活性，還具有抗惡性腫瘤、抗病毒、凝血和造血等多種重要的生物學(xué)作用[34]。結(jié)果顯示，模型組中TNF-α、INF-γ、IL-2、IL-4和IL-10含量均顯著低于對(duì)照組（p＜0.01）。經(jīng)過NDC-I預(yù)防性干預(yù)后，NDC-I組TNF-α、INF-γ、IL-2、IL-4和IL-10的含量顯著高于模型組（p＜0.01）（圖1c～1g）。前期文獻(xiàn)報(bào)道，環(huán)磷酰胺可導(dǎo)致大鼠免疫球蛋白和Th細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水平顯著降低，而NDC-I不僅可提高機(jī)體內(nèi)免疫球蛋白的含量，而且可以顯著提高免疫低下大鼠血清中細(xì)胞因子（TNF-α、IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10）水平，推測NDC-I可能通過影響細(xì)胞因子的分泌，維持Th1/Th2的平衡，進(jìn)而達(dá)到改善機(jī)體的免疫功能的作用。

2.4 NDC-I對(duì)脾臟和胸腺中LDH活性的影響

LDH是巨噬細(xì)胞活力的標(biāo)志酶之一，其活性反映了巨噬細(xì)胞的活化能力和非特異性免疫水平[35]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組脾臟和胸腺中LDH的活性均顯著低于對(duì)照組（p＜0.01）；經(jīng)NDC-I干預(yù)結(jié)束后，NDC-I組脾臟和胸腺中LDH的活性均顯著高于模型組（p＜0.01）。LDH活性不僅直接影響細(xì)胞內(nèi)糖酵解釋放能量的速率，而且在催化糖酵解的過程中會(huì)產(chǎn)生大量的乳酸，從而引起巨噬細(xì)胞胞內(nèi)pH值下降，有利于巨噬細(xì)胞胞內(nèi)免疫活性物質(zhì)和免疫功能的應(yīng)答[36]。環(huán)磷酰胺顯著降低了胸腺和脾臟中的LDH活性，而攝入NDC-I使得LDH活性顯著提高，說明NDC-I能夠減輕環(huán)磷酰胺對(duì)LDH活性的抑制作用，提高巨噬細(xì)胞活力。

2.5 NDC-I對(duì)脾臟和胸腺組織形態(tài)學(xué)的影響

脾實(shí)質(zhì)是由白髓、紅髓組成。由圖3可以看出，對(duì)照組（圖3a）的脾臟結(jié)構(gòu)完整，紅髓、白髓分界清晰，二者比例正常，淋巴小結(jié)較大，淋巴細(xì)胞排列緊密。模型組（圖3b）脾臟白髓面積下降，紅髓面積增加，淋巴小結(jié)減小，淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯下降，說明脾臟發(fā)生損傷。SA組（圖3c）和NDC-I組（圖3d）大鼠脾臟的白髓面積有所提高，紅髓和白髓分界更加清晰，淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增加，其病理損傷有所減輕。以上結(jié)果說明，NDC-I在一定程度上能夠恢復(fù)環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的脾臟損傷，對(duì)免疫器官有較為明顯的修護(hù)作用。

胸腺小葉是由皮質(zhì)、髓質(zhì)組成。由圖4可以看出，對(duì)照組（圖4a）胸腺形態(tài)清晰，狀態(tài)良好，淋巴細(xì)胞排列緊密。模型組（圖4b）胸腺淋巴細(xì)胞排列變得疏松，密度下降，說明胸腺免疫功能下降。SA組（圖4c）和NDC-I組（圖4d）均能提高淋巴細(xì)胞數(shù)量，淋巴細(xì)胞分布更加緊密，一定程度上改善了病理性損傷。說明NDC-I在一定程度上能夠恢復(fù)環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的胸腺萎縮，對(duì)免疫器官有較為明顯的修護(hù)作用。

脾臟和胸腺是機(jī)體主要的2個(gè)免疫器官，脾臟是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心，含有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。胸腺是T淋巴細(xì)胞分化和成熟的場所，通過接受抗原刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答，胸腺和脾臟指數(shù)能夠反映機(jī)體的免疫功能。在本實(shí)驗(yàn)中NDC-I使環(huán)磷酰胺所致的胸腺及脾臟指數(shù)明顯升高；同時(shí)，組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表示，NDC-I在一定程度上能夠恢復(fù)環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的脾臟和胸腺損傷。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，攝入NDC-I對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫低下大鼠的免疫器官均有較顯著的改善作用。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)探究了NDC-I對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫力低下大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示通過連續(xù)30 d給予NDC-I后，大鼠的白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著上升，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均增加，脾臟和胸腺組織病理學(xué)損傷減輕，表明NDC-I對(duì)環(huán)磷酰胺引起的免疫器官損傷具有一定的修護(hù)作用。同時(shí)，NDC-I能顯著提高環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的免疫低下大鼠體內(nèi)免疫球蛋白和輔助性Th細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，提高LDH活性，影響機(jī)體胞內(nèi)細(xì)胞糖酵解釋放能量的速率，進(jìn)而可能對(duì)巨噬細(xì)胞胞內(nèi)免疫活性物質(zhì)的釋放和免疫功能的應(yīng)答具有促進(jìn)作用。綜上所述，適量攝入NDC-I對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫低下大鼠的多項(xiàng)免疫功能均有較顯著的改善作用，而關(guān)于NDC-I免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究，以期為NDC-I的綜合開發(fā)和利用提供新的研究思路。